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糖基化對(duì)蛋白藥物的療效，穩(wěn)定性，免疫 原性具有重要點(diǎn)影響。以單克隆抗體為例， 常見的N-糖型主要為G0F、G1F、G2F、G1FGlcNAc、G0F-GlcNAc等；如果出現(xiàn)OligoMan、 Gal-a-1,3-Gal、NGNA、Xyl-1,2 Fuc-1,3等糖型， 則會(huì)影響免疫原性或半衰期，需要避免；另 一方面，可以細(xì)胞工程及分子生物學(xué)技術(shù)， 提高A-Fuc，GlcNAc bisecting，G2F， Hyper Sialyation(NANA)的含量，以增強(qiáng)ADCC，CDC， Anti-inflammatory 等效能。寡糖為非模板合成， 并呈樹狀結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，僅由6種單 糖組成的寡糖鏈，其理論結(jié)構(gòu)即達(dá)到驚人的 1012種。這就要求用于寡糖的分析設(shè)備具有強(qiáng) 悍的分析性能。Thermo Fisher開發(fā)了一系列簡(jiǎn)單、的液相色譜-質(zhì)譜表征方法，涵蓋 了從糖鏈結(jié)構(gòu)分析、到糖基化位點(diǎn)鑒定、再 到糖肽解析的完整分析流程（圖2）。

一、寡糖鏈分析 N-糖鏈（由天冬酰胺連接寡糖）結(jié)構(gòu)分析 包括寡糖鏈釋放、標(biāo)記、液質(zhì)聯(lián)用分析和數(shù) 據(jù)處理四個(gè)步驟（圖2）[1] 。寡糖鏈釋放根據(jù) 不同的糖基化類型選擇不同的方法，N-糖鏈主 要使用PNGase F。衍生化標(biāo)記步驟可以增強(qiáng)寡 糖的質(zhì)譜響應(yīng)。其中，還原末端標(biāo)記2-AB等苯 胺或雜環(huán)化合物還可使寡糖鏈通過(guò)熒光檢測(cè)， 全甲基化標(biāo)記增強(qiáng)寡糖鏈的疏水性，實(shí)現(xiàn)反 相分離檢測(cè)。以Q-Exactive為代表的Orbitrap超

高分辨質(zhì)譜具有高的靈敏度優(yōu)勢(shì)，使用其直 接分析未標(biāo)記的糖鏈也可以取得滿意的效果。 寡糖碎片質(zhì)譜可使用SimGlycanTM軟件進(jìn)行全 自動(dòng)結(jié)構(gòu)解析，獲得寡糖鏈精細(xì)結(jié)構(gòu)信息。在寡糖色譜分析中，專門為寡糖分離設(shè)計(jì) 的GlycanPac AXH-1/AXR-1色譜柱，結(jié)合了弱陰 離子交換WAX和親水相互作用HILIC (AXH-1)/反 相RP (AXR-1)兩種保留機(jī)理，能夠率地分 析復(fù)雜寡糖鏈混合樣本。經(jīng)典的HILIC/RP機(jī)理 可以根據(jù)電荷數(shù)、極性、大小實(shí)現(xiàn)寡糖鏈分 離，而WAX機(jī)理保留和選擇帶負(fù)電荷的寡糖 鏈，對(duì)含唾液酸的寡糖鏈具有很好的分離效 果。使用GlycanPac色譜柱分析2-AB標(biāo)記的牛 胎球蛋白(Bovine Fetuin) N-糖鏈，結(jié)果表明寡 糖鏈得到有效分離，特別是對(duì)含有唾液酸的寡糖的分離效果良好（圖3A）。即使分析未 標(biāo)記的天然牛胎球蛋白N-糖鏈（圖3B），仍 然獲得了理想的分離效果[2,3] 。

以 Q-Exactive 為代表的靜電場(chǎng)軌道阱 Orbitrap具有10萬(wàn)以上的超高分辨率和amol級(jí) 的超高靈敏度，結(jié)合高能碎裂(HCD)模式，能 獲得豐富的碎片信息，并分辨和檢測(cè)寡 糖。通過(guò)牛胎球蛋白三天線復(fù)雜型N-糖鏈的二 級(jí)質(zhì)譜分析（圖4A）可以看出，即使是寡糖鏈沒有被標(biāo)記，譜圖仍然獲得了豐富的高強(qiáng) 度碎片信號(hào)，特別是B/Y、C/Z等跨環(huán)斷裂信息， 對(duì)寡糖鏈精細(xì)結(jié)構(gòu)的解析具有重要作用。實(shí) 驗(yàn)在牛胎球蛋白中成功解析了29種不同結(jié)構(gòu) 的N-糖鏈（圖4B），其中絕大部分為含唾液 酸的寡糖鏈，證明UHPLC-Orbitrap對(duì)復(fù)雜寡糖 鏈的強(qiáng)大分析能力 [4] 。 GlycanPac 色譜與 Orbitrap結(jié)合還實(shí)現(xiàn)了僅糖苷鍵/構(gòu)象不同的同

專業(yè)糖鏈結(jié)構(gòu)解析軟件SimGlycanTM可實(shí)現(xiàn) 對(duì)復(fù)雜寡糖鏈譜圖的全自動(dòng)解析。將實(shí)驗(yàn)獲 得的寡糖鏈數(shù)據(jù)與內(nèi)置數(shù)據(jù)庫(kù)中寡糖鏈的理 論碎片譜圖匹配，分別獲得糖苷鍵斷裂、雙 糖苷鍵斷裂、跨環(huán)斷裂、跨環(huán)斷裂+糖苷鍵斷 裂的匹配率（圖6），進(jìn)而計(jì)算得到寡糖鏈的 結(jié)構(gòu)解析結(jié)果[6] 。此外，還可以利用線性離子阱質(zhì)量分析器 的多級(jí)功能(MSn)，對(duì)同分異構(gòu)寡糖鏈進(jìn)行多級(jí)碎裂和檢測(cè)，獲得單糖構(gòu)象、糖苷鍵連接 等精細(xì)結(jié)構(gòu)的更多差異信息，從多角度實(shí)現(xiàn) 同分異構(gòu)寡糖鏈的結(jié)構(gòu)解析和分辨[7] 。

二、糖基化位點(diǎn)分析 N-糖基化位點(diǎn)鑒定通常使用PNGase F 酶釋 放糖鏈，使肽段上產(chǎn)生去糖基化位點(diǎn)，并在 肽段上產(chǎn)生去糖基化痕跡：天冬酰胺(N)發(fā)生 脫氨基化，造成0.9840 Da的質(zhì)量增加。通過(guò) 質(zhì)譜尋找發(fā)生+0.9840 Da的天冬酰胺，以及N- 糖基化保守序列NXS/T (X代表脯氨酸以外的任 何氨基酸)過(guò)濾，獲得可信的鑒定結(jié)果（圖8）。 為了避免天然脫氨基化造成的假陽(yáng)性，可以在18O水中進(jìn)行酶切，使去糖基化位點(diǎn)含有一 個(gè)18O，形成+2.9890Da，可與天然脫氨基區(qū)分。

糖基化位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與確證對(duì)質(zhì)譜的分辨 率與靈敏度具有較高要求。Orbitrap由于具有 超高分辨率和超高靈敏度，無(wú)論對(duì)于單抗等 純蛋白樣品、還是全細(xì)胞蛋白等復(fù)雜樣品， 都是是糖基化位點(diǎn)表征的工具。目前糖 基化位點(diǎn)大的數(shù)據(jù)集，共從小鼠組織與血 漿中注釋了6367個(gè)糖基化位點(diǎn)[8] 。該實(shí)驗(yàn)采用 用PNGase F 釋放糖鏈并標(biāo)記18O方法，使用 Orbitrap鑒定糖基化位點(diǎn)，共鑒定到6367個(gè)位點(diǎn)，其中5753個(gè)位點(diǎn)是沒有記載的新位點(diǎn)。 該研究對(duì)糖蛋白的研究具有重要意義（圖9）， 也展示出了Orbitrap超群的性能。在相對(duì)簡(jiǎn)單 的抗體及其他蛋白藥物糖基化位點(diǎn)表征中， Orbitrap更可毫無(wú)疑問地勝任此工作[9] 。

三、糖肽分析 糖肽分析前處理簡(jiǎn)單，能同時(shí)鑒定糖基化 位點(diǎn)和解析寡糖鏈結(jié)構(gòu)，并獲得位點(diǎn)特異性 糖鏈信息，即微觀不均一性。但是糖肽解析 比糖鏈與糖肽分開解析的傳統(tǒng)方法更為復(fù)雜： 寡糖鏈離子化效率較低；相比肽段骨架更易 碎裂，造成肽段骨架難以充分碎裂；譜圖非 常復(fù)雜，傳統(tǒng)搜庫(kù)手段。HCD高能碎 裂相比傳統(tǒng)CID能獲得更豐富的碎片信息，使 糖肽的寡糖鏈和肽段骨架充分碎裂。Orbitrap

超高分辨質(zhì)量分析器能有效分辨糖肽產(chǎn)生的 復(fù)雜碎片，避免碎片離子間的相互干擾，提 高離子化效率較低的寡糖碎片響應(yīng)。ByonicTM 可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜糖肽譜圖的全自動(dòng)數(shù)據(jù)處理， 解析肽段骨架序列和寡糖鏈結(jié)構(gòu)。

單抗藥物利妥昔(Rituximab)經(jīng)Trypsin酶切 后，使用Q-Exactive在線分析，碎裂模式為 HCD，并使用ByonicTM解析譜圖。圖10展示了 糖肽EEQYNSTYR的譜圖解析結(jié)果，譜圖中存在 著豐富的糖肽碎片離子，并獲得超高質(zhì)量精 度的可靠匹配，確定糖鏈結(jié)構(gòu)為G0F。特別是 低分子量端的單糖和寡糖碎片，能夠作為診 斷離子，進(jìn)一步確證糖肽解析結(jié)果[10,11] 。

融合蛋白藥物通常為糖蛋白，其糖基化 比單抗更為復(fù)雜。單抗寡糖鏈結(jié)構(gòu)已研究的 較為透徹，但融合蛋白存在諸多未知寡糖鏈，這類糖肽的解析普通液質(zhì)難以勝任。Orbitrap 超高分辨率、超高質(zhì)量精度和靈敏度為未知 糖肽解析提供了有效解決方案。實(shí)驗(yàn)使用 Orbitrap對(duì)高度糖基化的一種Fc融合蛋白藥物 進(jìn)行了完整糖肽解析。該融合蛋白同時(shí)含有 多個(gè)N-糖和O-糖位點(diǎn)，寡糖鏈結(jié)構(gòu)未知。以糖 肽TKPREEQYNSTYR解析結(jié)果為例（圖11）， HCD譜圖同時(shí)獲得了豐富的寡糖鏈碎片和肽段 骨架碎片，使用ByonicTM得到可靠鑒定結(jié)果 （圖11A）。由于寡糖鏈存在諸多同分異構(gòu)體， 因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用了SimGlycanTM確證寡糖 鏈結(jié)構(gòu)，該寡糖鏈結(jié)構(gòu)確證為三鏈高甘露糖 型 （ 圖 11B ） 。 解析結(jié)果匯總表明 ， 僅 TKPREEQYNSTYR上N317一個(gè)位點(diǎn)，就有15種 結(jié)構(gòu)各異的寡糖鏈（圖11C）。實(shí)驗(yàn)共獲得2 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、16個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，83種 位點(diǎn)特異的寡糖鏈結(jié)構(gòu)，為該融合蛋白的研 究和申報(bào)提供了重要表征信息[12] 。

Orbitrap質(zhì)量分析器與HCD高能碎裂能有 效應(yīng)對(duì)復(fù)雜未知糖肽解析的挑戰(zhàn)。對(duì)于一些 仍無(wú)法解析的情況，還可以利用多級(jí)裂 解MSn獲得寡糖鏈精細(xì)結(jié)構(gòu)，或通過(guò)電子傳遞 裂解ETD得到更多肽段骨架碎裂，獲得與HCD 互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)信息[12-16] 。

四、ETD與O-Linked糖肽分析 O-Linked糖基化，主要發(fā)生在絲氨酸（S） 與蘇氨酸（T）殘基。在對(duì)O-Linked糖基化進(jìn) 行位點(diǎn)分析時(shí)，會(huì)遇到較N-Linked糖基化更大 的困難。一方面，O-Linked糖基化分析中，缺 乏像N-Linked糖基化分析里使用的PNGases F糖

苷酶，而難以進(jìn)行去糖基化位點(diǎn)質(zhì)量標(biāo)記。 另一方面。在多肽序列中，S與T經(jīng)常密集出現(xiàn)， 如果使用常規(guī)的碰撞誘導(dǎo)解離（CID）方法， 糖苷鍵將成為主要的斷裂碎片，因此難于獲 得豐富的肽段碎片信息，導(dǎo)致序列及O-Linked 糖基化位點(diǎn)分析困難。因此O-Linked糖基化分 析需要使用到ETD（電子傳遞解離）技術(shù)。ETD優(yōu)先斷裂肽段骨架，避免了寡糖鏈的碎裂， 能為O-糖肽提供有效信息。通過(guò)ETD分析人血 清富組氨酸糖蛋白（HRG）T271-284肽段的兩 種不同寡糖鏈結(jié)構(gòu)的O-糖肽，獲得了豐富的 肽段骨架碎片信息（c/z系列離子），而寡糖 鏈得以有效保留，降低了譜圖復(fù)雜性，有利 于糖基化位點(diǎn)與結(jié)構(gòu)解析（圖12）[17] 。

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