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賽默飛與合作實(shí)驗(yàn)室成功開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化HRMS1-DIA方法

關(guān)注我們，更多干貨和驚喜好禮癌癥Moonshot計(jì)劃啟動(dòng)后，出現(xiàn)了許多精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)項(xiàng)目，該計(jì)劃旨在通過改善早期發(fā)現(xiàn)，患者分類以及監(jiān)測(cè)治療效果和復(fù)發(fā)來(lái)增強(qiáng)癌癥患者的管理，從而加速癌癥研究。有關(guān)蛋白質(zhì)型的信息，定義為蛋白質(zhì)組的實(shí)際狀態(tài)，其數(shù)量，時(shí)間和空間的表達(dá)以及與基因型的相關(guān)性（所謂的蛋白質(zhì)組學(xué)），將大大增加我們對(duì)包括癌癥在內(nèi)的各種人類疾病的理解。在這一過程中，迫切需要一種質(zhì)譜分析策略，以提供可靠且可重現(xiàn)的定量數(shù)據(jù)。

Orbitrap已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室的金標(biāo)準(zhǔn)，賽默飛高級(jí)產(chǎn)品經(jīng)理軒玥博士聯(lián)合多個(gè)實(shí)驗(yàn)室瞄準(zhǔn)數(shù)據(jù)非依賴性質(zhì)譜采集（Data-independent acquisition，DIA）的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組方法，用于支持精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的高通量臨床蛋白質(zhì)組學(xué)分析。作者首先建立了高通量、簡(jiǎn)化的HRMS1-DIA工作流程，該工作流程在隨后的11個(gè)實(shí)驗(yàn)室中連續(xù)7天測(cè)試和集中的數(shù)據(jù)處理；開發(fā)了一種質(zhì)量控制（QC）系統(tǒng)，以監(jiān)視整個(gè)工作流程的性能，即時(shí)發(fā)現(xiàn)儀器性能的變化，并在必要時(shí)指導(dǎo)故障排除，確保維持較高水平的數(shù)據(jù)質(zhì)量，以實(shí)現(xiàn)大型臨床隊(duì)列研究所需的通量；在整個(gè)研究過程中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都使用一套完善的非標(biāo)記定量樣品對(duì)定量性能進(jìn)行評(píng)估，從而可以進(jìn)行分布式和縱向數(shù)據(jù)分析，并可以在大數(shù)據(jù)分析時(shí)進(jìn)行比較和標(biāo)準(zhǔn)化。

簡(jiǎn)化的HRMS1-DIA工作流程進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析

?鑒定QC:

PierceTM Hela Protein Digest Standard

?定量QC:

Sample A(20%E.coli,15%Yeast和65%Hela),

Sample B(4%E.coli,30%Yeast和65%Hela)

?色譜條件:

ES806(Acclaim PepMap RSLC C18, 2 µm,100 Å,150 µm i.d. × 150 mm),

60min色譜梯度，流速1.2µL/min

?質(zhì)譜:QEHF

?DIA數(shù)據(jù)采集方法:

HRMS1-DIA，1個(gè)cycle包括3個(gè)R120K MS1掃描，每個(gè)MS1掃描之間穿插18個(gè)15 Da 隔離窗口的R30K DIA MS / MS掃描（總共54個(gè)DIA MS/MS掃描）。高分辨的一級(jí)用于定量分析，二級(jí)用于肽段鑒定。此處采用的HRMS1-DIA方法中，MS1掃描周期速率（1.7s）與MS2循環(huán)時(shí)間無(wú)關(guān)，可確保有足夠數(shù)量MS1掃描的數(shù)量保證定量的重現(xiàn)性。相比之下，MS2采集時(shí)設(shè)置相對(duì)較窄15Da的隔離窗口，能夠大限度的提高肽檢測(cè)效率。

?數(shù)據(jù)分析:

11個(gè)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)統(tǒng)一上傳至Thermo Cloud云平臺(tái)，SpectronautTM軟件提取DIA色譜峰。

HRMS1-DIA實(shí)驗(yàn)流程（點(diǎn)擊查看大圖）

鑒定QC質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)鑒定QC進(jìn)行系統(tǒng)質(zhì)控，作者提出了多個(gè)質(zhì)控的指標(biāo)，蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室可以作為參考，包括色譜的峰寬、MS1和MS2采集的點(diǎn)數(shù)、Precursor和蛋白數(shù)目以及定量的CV。只有符合QC相應(yīng)的指標(biāo)才能繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果不滿足條件，需要排查是色譜問題還是質(zhì)譜問題。

定量QC的質(zhì)控

定量QC的目的是考察HRMS1-DIA定量流程的準(zhǔn)確性，SampleA/B中Hela的理論比例是1:1，Yeast是1:2，E.coli是4:1。作者提出了兩種方法對(duì)定量QC進(jìn)行質(zhì)控：

（1）定量真實(shí)比值與理論比值的偏差，不超過25%；

（2）定量的重現(xiàn)性，CV小于25%。

HRMS1-DIA的重現(xiàn)性

Sample A和Sample B在11個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行7天的數(shù)據(jù)采集，一共產(chǎn)生了240個(gè)DIA數(shù)據(jù)，共鑒定超過7600個(gè)蛋白，其中4000個(gè)人蛋白，2000個(gè)酵母蛋白以及400個(gè)E.coli蛋白。首先看單個(gè)實(shí)驗(yàn)室7天內(nèi)定量的重現(xiàn)性，平均每個(gè)實(shí)驗(yàn)室每天均可以分別定量超過6500個(gè)蛋白；然后看實(shí)驗(yàn)室間的重現(xiàn)性，5784個(gè)蛋白被每個(gè)實(shí)驗(yàn)室定量到，4564個(gè)蛋白被每個(gè)實(shí)驗(yàn)室每天定量到。

HRMS1-DIA定量的重現(xiàn)性。（a）每個(gè)實(shí)驗(yàn)室平均定量到的蛋白，共定量的蛋白，共同定量到的蛋白數(shù)目和百分比；（b）各個(gè)實(shí)驗(yàn)室組合中共同定量的蛋白質(zhì)數(shù)量。（點(diǎn)擊查看大圖）

如何獲取HRMS1-DIA方法？

點(diǎn)擊文末左下角閱讀原文，可查看本實(shí)驗(yàn)HRMS1-DIA全部的方法，包括色譜、質(zhì)譜和數(shù)據(jù)分析方法，有興趣的老師可以查閱。文章中使用的液相色譜、液相色譜柱等備件我們已經(jīng)做成了相應(yīng)的貨號(hào)，可以和當(dāng)?shù)劁N售聯(lián)系。

詳細(xì)HRMS1-DIA方法

HRMS1-DIA工作流助力精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究（上）

HRMS1-DIA工作流助力精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究（下）

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