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1.前言 隨著治療性生物產(chǎn)品在藥物市場所占份額的不斷提高，各 國監(jiān)管機構(gòu)通過發(fā)布質(zhì)量源于設(shè)計（Quality by Design, QbD） 原則等手段，對生物藥的質(zhì)量控制提出了更高的要求。對于生 物制藥企業(yè)而言，在生產(chǎn)及批次放行過程中對關(guān)鍵質(zhì)量屬性 （critical quality attribute, CQA）和雜質(zhì)等進行鑒定、定量和監(jiān) 控就顯得尤為重要。傳統(tǒng)的質(zhì)控手段包括多種分離手段，如反 相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)、體積排阻色譜（size-exclusion chromatography, SEC）、離子交換色譜（ion-exchange chromatography, IEX）和毛細管電泳（capillary electrophoresis, CE）等。 2015年，Rogers等基于Orbitrap高分辨質(zhì)譜平臺發(fā)展了MultiAttribute Method（MAM），用于在一針進樣中同時對CQA進行 鑒定、定量和實時監(jiān)控[1]。自從MAM發(fā)布以來，獲得了業(yè)界的關(guān)注，在近年的學(xué)術(shù)會議中屢屢成為熱點議題[2]。 在本文中，我們使用Thermo Scientic™ Q Exactive™ Plus Orbitrap™ 高分辨質(zhì)譜平臺，串聯(lián)Thermo Scientic™ Vanquish™ Flex UHPLC系統(tǒng)，使用Thermo Scientic™ Chromeleon™ 7.2.9 Chromatography Data System (CDS) 與Thermo Scientic™ BioPharma Finder™ 3.2 軟件進行數(shù)據(jù)采集和處理(Figure 1)

 2. 實驗方法

a. 儀器及試劑 • Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer • Vanquish Flex UHPLC system • Thermo Scientic™ Accucore™ Vanquish™ C18+ UHPLC column, 1.5 μm, 2.1 × 150 mm • Thermo Scientic™ Acetonitrile, UHPLC-MS grade • Thermo Scientic™ Pierce™ Trypsin Protease MS grade • Thermo Scientic™ Pierce™ Formic Acid, LC-MS grade • Invitrogen™ UltraPure™ 1 M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 • 8.0 M Guanidine Hydrochloride Solution • Bio-Spin P-6 Gel Columns, Tris Buffer • Thermo Scientic™ Zeba Spin Desalting Columns, 0.5mL • Sodium Iodoacetate (IAC) BioUltra >98% purity • DL-Dithiothreitol (DTT) BioXtra ≥99% purity b. 實驗樣品 NISTmAb Humanized IgG1κ Monoclonal Antibody (NIST, RM 8671)。

c. 樣品前處理步驟 • 商業(yè)化NIST mAb標(biāo)準(zhǔn)品以溶液形式提供，溶于 12.5 mM Lhistidine + 12.5 mM L-histidine HCl (pH 6.0)體系中，濃度為 10.004 ± 0.08 mg/mL。取兩份10 μL NIST mAb標(biāo)準(zhǔn)品，分 別標(biāo)記為RA2和RA3，各加入90 μL Solution I(7 M GuanidineHCl, 100 mM Tris, pH 8.3)，將其濃度調(diào)整為1mg/mL。 • 還原：向上述樣品中分別加入2.0 μL Solution II (500 mM DTT) ，使DTT終濃度為10 mM，隨后室溫孵育30分鐘。 • 烷基化：還原結(jié)束后，向上述樣品中分別加入4.0 μL of Solution III(500 mM IAC)并用移液器充分混合，使IAC終濃度為20 mM，避光室溫孵育20分鐘。 • 溶液置換：烷基化結(jié)束后，向上述樣品中分別加入4.0 μL Solution IV (50 mM DTT)用于中和過量的IAC。隨后分別取 BioSpin-6 column和Thermo Scientic™ Zeba Spin Desalting Columns, 0.5mL各一支，按照其說明書分別將其溶液體系置 換為50 mM Tris（pH 7.9）。棄去下層溶液并更換新的1.5mL 外管，隨后向BioSpin-6 column中加入經(jīng)還原烷基化之后的 RA2樣品，向Zeba Spin Desalting Column中加入經(jīng)還原烷基 化之后的RA3樣品，1000×g轉(zhuǎn)速離心四分鐘后分別收集下層 溶液準(zhǔn)備酶解。 • 酶解：使用雙蒸水將Pierce Trypsin復(fù)溶為1mg/mL,溫和渦旋混 勻。按照酶：蛋白=1:10（w:w）的比例將胰酶溶液分別添加 至前述兩份NIST mAb樣品中，37 °C孵育30分鐘，加入甲酸 （終濃度為10%）終止酶解反應(yīng)，隨后將兩份樣品分別轉(zhuǎn)移 至樣品瓶中并置于液相自動進樣器里，待后續(xù)分析。

 d. 實驗方法設(shè)置 • 液相色譜：Vanquish Flex UHPLC system • 色譜柱：Accucore Vanquish C18+ UHPLC column (1.5 μm,2.1 × 150 mm) • 柱溫：50 °C（column oven Mode set to Still Air） • 自動進樣器溫度：5°C • 上樣量：每個樣品4 μL(約4μg酶解肽段) • 流動相： 0.1% formic acid in water (A1) / 0.1% formic acid in acetonitrile (B1) • 流速：0.250 mL/min. 

 質(zhì)譜條件如表2所示。其中用于肽圖分析的數(shù)據(jù)使用Top5 ddMS2 方法采集，BioPharma Finder 處理；CQA定量的數(shù)據(jù)使 用Full Scan MS only 方法采集，變色龍軟件處理。

e.數(shù)據(jù)處理軟件 使用Thermo Scientic BioPharma Finder 3.2軟件進行肽圖分 析，參數(shù)設(shè)置如表3所示。對兩份樣品的MS/MS數(shù)據(jù)進行搜 庫，以確定用于監(jiān)控和定量的CQA。

 參考之前的報道，在本文的研究中我們選定了如下的CQAs用于 定量：糖基化（glycosylation）、脫酰胺（deamidation）、天 冬氨酸異構(gòu)化（isomerization）和C端賴氨酸丟失（C-terminal lysine truncation）。對于每個CQA，我們選取了鑒定到的每個 電荷態(tài)的前四個同位素峰，在BioPharma Finder中另存為Target Peptide Workbook，并一鍵導(dǎo)出為BioPharma Finder workbook le (.wbpf)，隨后將其導(dǎo)入變色龍 Processing Method中的 MS Component Table。 任何新發(fā)現(xiàn)的CQA可以隨時添加進BioPharma Finder workbook 和變色龍方法中，這為方法開發(fā)和優(yōu)化階段提供了靈活 性。一旦在變色龍軟件中建立了標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法，即可將該 方法應(yīng)用于GMP環(huán)境下的應(yīng)用中。 接下來，使用Chromeleon CDS 7.2.9軟件進行CQA定量。我們 基于變色龍軟件中的MS Quantitative模板創(chuàng)建了MAM數(shù)據(jù)處理 的方法，基本參數(shù)如表4所示。在變色龍軟件中，可以對峰積分 的參數(shù)進行優(yōu)化，以確保積分結(jié)果一致且可信，從而得到準(zhǔn)確 的定量結(jié)果。

 3.實驗結(jié)果 本次實驗選取的兩份NIST mAb標(biāo)準(zhǔn)品來源于同一批次，通過 對比不同溶液置換耗材處理后選定CQA含量的變化趨勢，進而 研究不同耗材對CQA定量結(jié)果的影響。圖2展示了Biopharma Finder對兩個樣品進行肽圖分析的結(jié)果，可見在上樣量約4μg肽 段的情況下，NIST mAb標(biāo)準(zhǔn)品輕鏈覆蓋度≥96%，重鏈覆蓋度 ≥98%，除了一些胰酶酶切過短的肽段沒有鑒定到，其余區(qū)域均 可鑒定到肽段信息，為CQA的選取和定量提供了堅實的基礎(chǔ)。對于兩個樣品，我們分別進行了三針技術(shù)重復(fù)。表5展示了對主 要糖型的定量結(jié)果。由圖中可以看出，分別使用不同前處理耗 材的兩個樣品的六針進樣之間均呈現(xiàn)良好的重現(xiàn)性。

 圖3A展示了肽段FNWYVDGVEVHNAK上D283的異構(gòu)化比率和 N289的脫酰胺比率。由圖中不難發(fā)現(xiàn)，兩種不同溶液置換條件 下天冬氨酸異構(gòu)化和脫酰胺化比率并沒有顯著差異，表明對于這 兩種修飾，使用不同溶液置換耗材也無顯著差異。 以RA2樣品為例，進一步觀察發(fā)生天冬氨酸異構(gòu)化和未修飾峰的 對比，可見由于修飾/未修飾肽段色譜保留時間的差異，可以將 其分離開，在變色龍軟件中按照保留時間差異進行相應(yīng)設(shè)置，分 別提峰進行相對定量(圖3B)；得益于Orbitrap質(zhì)譜的高靈敏度，相 對含量只有未修飾峰約0.15%的異構(gòu)化峰也可以檢測到高質(zhì)量的 一級質(zhì)譜圖和準(zhǔn)確的肽段同位素峰分布(圖3C-F)。

 4.結(jié)論 在本實驗中，我們使用基于Thermo高分辨質(zhì)譜平臺的HR-MAM 流程對在前處理步驟中使用不同溶液置換耗材的NIST mAb標(biāo)準(zhǔn) 品進行了CQA的鑒定和定量。得益于HR-MAM流程的穩(wěn)健性、 靈活性、特異性和高靈敏度，我們可以在一次實驗中同時對多個 CQA進行監(jiān)控和定量。 對比不同溶劑交換前處理耗材的實驗結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)肽圖強度、色 譜峰型及分離與肽圖覆蓋度等無明顯差異，且與關(guān)鍵質(zhì)量屬性相 關(guān)的特定修飾，使用不同耗材處理得到的定量比率并無顯著區(qū) 別，更進一步證明了HR-MAM流程的穩(wěn)定性。

 參考文獻 1. Rogers, R., et al. Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics. MAbs,2015, 7, 881. 2. Rogers, R., et al. A view on the importance of “multi-attribute method” for measuring purity of biopharmaceuticals and improving overall control strategy. The AAPS Journal,2018, 20, 7.

表6展示了重鏈末端修飾的定量結(jié)果?？梢妼τ谥劓淐端的賴氨 酸丟失，即使采用了不同的前處理耗材，樣品之間修飾的定量 CV仍可保持在較低水平。