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寡核苷酸藥物的現(xiàn)狀

在1998年至2021年間獲得批準上市的寡核苷酸藥物有13種，見表1^[1]。多年來，基于寡核苷酸的治療方法在臨床上取得了快速的進展，可用于多種疾病的治療，如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝疾病、癌癥等。目前正在進行大量涉及寡核苷酸藥物治療的臨床試驗。

表1. 已獲批的寡核苷酸藥物的作用機理

和靶向疾病^[1]

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寡核苷酸藥物（RNA治療）的優(yōu)勢

眾所周zhi，RNA藥物已經(jīng)成為各種新的治療策略的理想候選方案，其相對于傳統(tǒng)治療藥物的主要優(yōu)勢如下^[1]。

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可靶向“無藥可治"的目標

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以RNA為基礎(chǔ)的藥物能夠靶向細胞內(nèi)幾乎任何遺傳成分，見圖1^[1]；其中許多成分使用其他技術(shù)可能被認為是“無藥可治"的，包括小分子和抗體藥物。

圖1.RNA療法可以靶向不同的細胞遺傳成分^[1]

02

可快速生產(chǎn)

?

一般來說，新型小分子或抗體藥物從開發(fā)到生產(chǎn)需要數(shù)年時間。然而，一旦確定了RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)和遞送方式，RNA藥物就可以被快速設(shè)計、合成并用于臨床試驗。CO  VID-19大流行能夠被遏制且顯著降低感染者疾病嚴重程度的原因之一是針對CO  VID-19的疫苗開發(fā)和生產(chǎn)速度極快。

03

具有長效作用

?

雖然天然RNA很容易被天然核酸酶降解，但合成RNA進行各種修飾后，其穩(wěn)定性將大大提高。此外，當(dāng)RNA被脂質(zhì)體等載體包裹時，在系統(tǒng)給藥后，RNA能有效避免核酸酶的攻擊，從而延長壽命。

04

可進行個性化治療

?

對RNA化學(xué)結(jié)構(gòu)及其遞送系統(tǒng)進行個性化設(shè)計，即可針對個體特殊疾病開發(fā)對應(yīng)的RNA藥物，且速度快、成本低。

05

無遺傳毒性風(fēng)險

?

與DNA藥物治療相比，RNA治療沒有顯著的遺傳毒性。這是因為DNA分子通過病毒載體被傳遞到細胞中，這種載體有可能整合到基因組中并導(dǎo)致突變。而使用RNA藥物治療可以避免這種潛在風(fēng)險。

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寡核苷酸藥物(mRNA疫苗)的商業(yè)化

CO   VID-19使mRNA 疫苗從一項相對小眾的技術(shù)迅速成為主流，目前全球使用了數(shù)億劑mRNA疫苗。由于mRNA生產(chǎn)具有模塊化特性，Moderna、BioNTech和CureVac等公司開發(fā)mRNA用于癌癥疫苗、蛋白質(zhì)替代療法和其他疫苗。這是因為mRNA不同于小分子和蛋白質(zhì)藥物，它可以被定制以編碼幾乎任何蛋白質(zhì)，同時保留幾乎相同的化學(xué)特征。這使得核苷酸修飾、脂質(zhì)納米顆粒（LNP）配方和制造等其他關(guān)鍵技術(shù)在本質(zhì)上可以保持不變。自2012年以來，一項臨床前概念研究表明，mRNA疫苗非常適合快速應(yīng)對流行疾病，而CO   VID-19在全球的肆虐提出了將這些技術(shù)商業(yè)化的迫切需求^[2]。

04

賽默飛Vanquish Flex-ISQ EM結(jié)合Chromeleon IPD助力寡核苷酸分析

賽默飛生物兼容的Vanquish Flex超高效液相色譜儀結(jié)合單四級桿質(zhì)譜儀ISQ EM，見圖2，在離子對反相色譜流動相體系下使15T、20T、25T、30T、35T的寡聚胸腺嘧啶脫氧核苷酸（Oligodeoxythymidines，Oligo (dT)n）實現(xiàn)分離。并通過Chromeleon色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)配備去卷積權(quán)限（Intact Protein Deconvolution，IPD）同時運行色譜方法、采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以及利用IPD功能確定不同長度寡核苷酸片段的分子量。

圖2.Vanquish Flex超高效液相色譜儀-單四級桿質(zhì)譜儀ISQ EM

儀器配置：

• 系統(tǒng)底座：Vanquish System Base (VF-S02-A-02)

• 泵：Vanquish Dual Pump F（VF-P32-A, 150µl靜態(tài)混合器，50µl 毛細管混合器）

• 自動進樣器：Vanquish Dual Split Sampler FT (VF-A40-A, 25µL定量環(huán))

• 柱溫箱：Column Compartment H (VH-C10-A，主動預(yù)加熱器)

• 檢測器：Variable Wavelength Detector C (VC-D40-A，2.5ul流通池)

              ISQ EM

•色譜軟件： Chromeleon 7.3.0配備去卷積權(quán)限PN:7200.0046

色譜條件：

• 色譜柱：C18 column，1.7µm，2.1×50mm

• 流動相：A：15mM TEA和400mM HFIP水溶液；B：50%流動相A-50%甲醇

• 流速：0.2 mL·min-1，梯度洗脫見表2

• 進樣量： 25ul

• 柱    溫： 60℃（still air）

• UV檢測器：260nm，5Hz

• 自動進樣器溫度：4℃

表2. 梯度洗脫程序

質(zhì)譜參數(shù)：

• Vaporizer temperature：350℃

• Ion transfer tube temperature：350℃

• Source voltage：-2000 V

• Sheath gas pressure：75 psi

• Aux gas pressure：7.5 psi

• Sweep gas pressure：0 psi

• Full scan Mass range：600-2000 m/z

• Dwell/scan time：0.5 s

• Polarity：Negative

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實驗結(jié)果與討論

如圖3所示，在該色譜條件下五種寡核苷酸可實現(xiàn)良好分離。在m/z 600-2000范圍內(nèi)對15T、20T、25T、30T、35T寡核苷酸的所有電荷態(tài)進行質(zhì)量確認，發(fā)現(xiàn)不同長度寡核苷酸的質(zhì)量準確度良好，質(zhì)量偏差＜0.2 Da。

圖3. Oligo (dT)n紫外色譜圖和總離子流圖

利用Chromeleon色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)的IPD功能解析寡核苷酸分子量，分析參數(shù)設(shè)置與結(jié)果界面如圖4所示。連續(xù)進樣4次，通過IPD去卷積功能確認15T、20T、25T、30T、35T寡核苷酸的相對分子質(zhì)量，見表3，質(zhì)量準確度范圍為0.00Da-0.47Da，且重復(fù)性很好，相對標準偏差（RSD）＜0.006%。  

圖4. Chromeleon去卷積功能解析分子量軟件界面

（1）進樣序列；（2）目標組分列表；（3）去卷積參數(shù)設(shè)置；（4）和（6）總離子流圖；（5）全掃描質(zhì)譜圖；（7）去卷積譜圖；（8）源質(zhì)譜圖；（9）去卷積結(jié)果組成列表（點擊查看大圖）

表3. 寡核苷酸去卷積結(jié)果

展望

寡核苷酸的質(zhì)量控制需要開展大量實驗，以進行分子量確認和樣品純度與產(chǎn)率的測定。由于寡核苷酸在260 nm處有很強的吸收，因此可以很容易地通過紫外檢測進行定量。然而，分子量確認需要質(zhì)譜分析；質(zhì)量控制也需要一個快速和穩(wěn)健的方法，以確保實現(xiàn)高通量檢測。以上均可以通過將賽默飛生物兼容的Vanquish Flex超高效液相色譜儀與單四極桿質(zhì)譜儀ISQ EM結(jié)合來實現(xiàn)。ISQ EM是專為色譜儀的日常應(yīng)用和操作而設(shè)計的，它*集成到Chromeleon色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)中，該系統(tǒng)具有完整蛋白、多肽和寡核苷酸ISQ EM數(shù)據(jù)去卷積分析能力，具體方法可參照相關(guān)應(yīng)用文獻^[3-6]。

參考文獻：

[1] Kim YK. RNA therapy: rich history, various applications and unlimited future prospects. Experimental & Molecular Medicine. 2022, 19, 1-11.

[2] Webb, C., et al. Current status and future perspectives on MRNA drug manufacturing. Molecular pharmaceutics. 2022, 19, 1047-1058.

[3] AN 000457: High-throughput analysis of oligonucleotides using a single quadrupole mass spectrometer for quality control.

[4] AN 72820：Oligonucleotide characterization for quality control and increased productivity by single quadrupole mass spectrometer with extended mass range.

[5] AN 22013：基于Chromeleon軟件的核酸樣品分子量合規(guī)質(zhì)量控制.

[6] TN 73670：Quality control of oligonucleotides with a single quadrupole mass.

[7] AN 72818:  Impurity profiling of the synthetic peptide LL-37 using high-performance liquid chromatography with combined UV and single quadrupole mass spectrometric detection