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縱觀近年來全球生物制藥行業(yè)的發(fā)展趨勢，單克隆抗體所占shichang份額越來越高，艾伯維公司的阿達(dá)木單抗注射液更是多年穩(wěn)坐全球銷售額“藥王"的寶座，帕博利珠、烏司奴和納武利尤等多個(gè)單抗產(chǎn)品也均在2021年全球藥品jian端|銷售額T OP100中占有一席之地。

由于蛋白類藥物的電荷異質(zhì)性可能導(dǎo)致生產(chǎn)過程中的產(chǎn)品降解等，從而對產(chǎn)品的安全性和有效性造成影響，所以對蛋白類藥物的電荷變異體深入表征和評估是十分必要的。目前已知多種修飾會(huì)導(dǎo)致電荷變異體的產(chǎn)生，除常見的C端賴氨酸丟失、N端焦谷氨酸環(huán)化、脫酰胺化、氧化和糖基化等修飾外，還有多種可能的修飾會(huì)影響蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（Isoelectric point, pI），進(jìn)而影響蛋白的電荷異質(zhì)性。所以采用先進(jìn)的分析技術(shù)對電荷變異體進(jìn)行分離和深入表征就顯得尤為必要。

全柱成像等電毛細(xì)管聚焦電泳（ Imaged capillary isoelectric focusing, icIEF）技術(shù)由于其通量高、易于使用、方法開發(fā)快速和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛用于治療性蛋白產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)過程中。而將高分辨質(zhì)譜與icIEF平臺(tái)聯(lián)合使用，可以充分發(fā)揮二者的優(yōu)點(diǎn)，從而使治療性蛋白產(chǎn)品的高效分離和深入表征成為可能。

在本文的工作中，通過將iCIEF技術(shù)與高分辨質(zhì)譜聯(lián)合使用，我們對帕博利珠這一人源化IgG4單克隆抗體的電荷變異體分別進(jìn)行了完整分子量層面和肽圖層面的表征。我們使用的CEInfinite iCIEF平臺(tái)（來自于Advanced Electrophoresis Solution Ltd., AES有限公司）除了高質(zhì)量的iCIEF-UV功能外，還可以與高分辨質(zhì)譜直接在線串聯(lián)，測定電荷變異體的分子量，無需額外轉(zhuǎn)換接口，且該平臺(tái)從質(zhì)譜直連模式轉(zhuǎn)換為全自動(dòng)的餾分收集模式也非常簡便快捷，無需安裝/拆xie任何模塊。

圖1A為iCIEF-MS直連模式的工作原理圖，圖1B則為餾分收集模式工作原理圖。

(B)

圖1. CEInfinite iCIEF平臺(tái)工作原理圖。

(A) iCIEF-MS 直連模式。(B) 餾分分離及收集模式。

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iCIEF-MS直連模式的優(yōu)點(diǎn)之一就是無需繁瑣的樣品前處理步驟，可以在研發(fā)/生產(chǎn)的任意階段獲取樣品后，快速進(jìn)行完整分子量層面的電荷變異體監(jiān)控。下圖2及圖3展示了我們使用iCIEF-MS直連技術(shù)分析帕博利珠單抗電荷變異體的結(jié)果，可見即使是pI僅差0.02的堿峰B1和主峰，也可以在iCIEF上得到基線分離(圖2)，隨后的高分辨質(zhì)譜分子量測定結(jié)果顯示該堿峰與主峰相比，主要差異是其中一條重鏈的N端未發(fā)生焦谷氨酸環(huán)化。另外觀察原始質(zhì)譜譜圖不難發(fā)現(xiàn)，得益于Orbitrap高分辨質(zhì)譜的靈敏度，即使是強(qiáng)度比主峰低2~3個(gè)數(shù)量級的堿峰B3，仍可得到糖型分布清晰的譜圖，并可通過解卷積觀察到該峰中各個(gè)組分的分子量（圖3）。表1展示了iCIEF-MS直連測得的每個(gè)峰中主要的電荷變異體種類。

圖2. (A)帕博利珠 iCIEF- UV 分離譜圖。(B) 帕博利珠單抗各個(gè)電荷變異體百分含量，上樣量為柱上1.6μg。A1-A4, 酸峰; Main, 主峰; B1-B3, 堿峰。

圖3. iCIEF-MS在線直聯(lián)分析帕博利珠電荷變異體。

(A)，主峰與所有堿峰原始質(zhì)譜圖對比。(B)，堿峰B1(pI=7.59)與主峰(pI=7.57)解卷積結(jié)果鏡像圖對比。(C)，基于肽圖得到的主峰和堿峰B1重鏈N端焦谷氨酸環(huán)化比率。(D)，堿峰B3解卷積結(jié)果。

表1 iCIEF-MS在線直聯(lián)鑒定帕博利珠電荷變異體。HC，重鏈。

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通過iCIEF-MS在線直連對帕博利珠單抗的電荷變異體進(jìn)行分離并測定其完整分子量后，為了對電荷變異體進(jìn)行更加深入的表征，我們使用CEInfinite iCIEF平臺(tái)的餾分收集功能，對其電荷變異體的每個(gè)峰離線收集后進(jìn)行酶解，隨后上樣至高分辨液質(zhì)聯(lián)用平臺(tái)進(jìn)行肽圖分析。圖4展示了離線餾分收集及餾分純度的確認(rèn)過程。在餾分收集過程中，得益于iCIEF平臺(tái)分離良好的穩(wěn)定性，可以通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定每個(gè)峰的出峰時(shí)間后，設(shè)定隊(duì)列自動(dòng)進(jìn)行循環(huán)收集，從而節(jié)省實(shí)驗(yàn)室人力，提高收集通量。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定五個(gè)峰（兩個(gè)酸峰，兩個(gè)堿峰以及主峰）進(jìn)行收集，總共進(jìn)行了20針重復(fù)進(jìn)樣，每針上樣量為8μg，將多針重復(fù)進(jìn)樣的相同峰進(jìn)行合并，即使是含量很低的電荷異質(zhì)體，也能夠收集到足夠量的蛋白進(jìn)行后續(xù)分析。

圖4A展示的是其中10針進(jìn)樣的譜圖重疊，可見系統(tǒng)具有良好的重現(xiàn)性。圖4B中展示了每個(gè)峰的峰面積相對含量（以所有峰面積總和為100%計(jì)，下同），可見有三個(gè)酸/堿峰的峰面積相對含量均小于10%，其中酸峰A2的峰面積相對含量只有2.40%。無論是相對含量最高的主峰，還是低含量的酸/堿峰，多針重復(fù)進(jìn)樣峰面積CV值均小于7%，證明了系統(tǒng)良好的重現(xiàn)性。圖4C是取了五針重復(fù)進(jìn)樣收集后合并的餾分進(jìn)行峰純度的確認(rèn)，可見不同的峰之間均得到了良好分離。

圖4. 離線餾分收集及餾分純度的確認(rèn)。

(A) 餾分收集,10針重復(fù)進(jìn)樣UV譜圖重疊。(B）每個(gè)峰的在所有峰中的相對百分含量，以峰面積計(jì)算。(C) 離線收集的五個(gè)餾分，重新進(jìn)樣以確認(rèn)峰純度。

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圖5展示了主峰肽圖覆蓋率及色譜圖。離線收集的餾分經(jīng)胰酶酶切，輕重鏈均可達(dá)到98%以上覆蓋率，且所有肽段均包含二級譜圖信息。色譜分離良好，絕大多數(shù)色譜峰中包含的肽段均得到了鑒定。

圖5 主峰（pI=7.57）序列覆蓋度以及色譜圖。

(A)，序列覆蓋度。(B)，色譜圖。綠色陰影部分表示該色譜峰中的肽段來源于輕鏈，粉色陰影部分表示該色譜峰中的肽段來源于重鏈。

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通過對收集到的五個(gè)峰分別酶解，隨后進(jìn)行UHPLC-MSMS肽圖分析，我們對每個(gè)峰中重鏈末端、糖型和側(cè)鏈常見PTM的變化趨勢進(jìn)行了深入研究。圖6展示的是末端修飾的變化情況。由于重鏈C端賴氨酸丟失、輕/重鏈N端焦谷氨酸環(huán)化等修飾會(huì)對產(chǎn)品的電荷異質(zhì)性產(chǎn)生影響，分析科學(xué)家們通常都會(huì)對這些修飾進(jìn)行監(jiān)控。從圖6中不難發(fā)現(xiàn)，相較于酸峰和主峰，兩個(gè)堿峰中重鏈C端賴氨酸丟失的比率均有較為明顯的下降。另外堿峰B1中焦谷氨酸環(huán)化比率明顯降低，只有30%左右，而其他的四個(gè)峰此修飾比率均在90%以上，這一結(jié)果也與前文中的質(zhì)譜直連結(jié)果相吻合。圖6C中的焦谷氨酸環(huán)化肽段二級譜圖，碎片離子豐富，信噪比高，也證明了定性定量結(jié)果的可信度。

圖6. 所有峰中末端修飾定性定量結(jié)果。所有定量結(jié)果均為三針平行進(jìn)樣的平均值，下同。

(A), 所有峰中賴氨酸丟失/焦谷氨酸環(huán)化比率對比。(B), 主峰中焦谷氨酸環(huán)化肽段二級碎片覆蓋圖。(C), 主峰中焦谷氨酸環(huán)化肽段二級譜圖。

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重鏈上的保守N糖基化位點(diǎn)的糖鏈修飾情況也是需要監(jiān)控的修飾之一。圖7中展示的是所有峰中N-糖鏈定性定量結(jié)果，可見在酸峰中，含有唾液酸的糖鏈比率上升，而堿峰中A1G0F和A2G0的相對含量有所增高。

圖7. 所有峰中N-糖鏈定性定量結(jié)果。局部放大圖，相對含量小于6%的糖型。

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已知脫酰胺化會(huì)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、折疊和聚集等造成影響，且單抗中某些關(guān)鍵位點(diǎn)的脫酰胺化可能會(huì)影響產(chǎn)品的安全性和有效性，所以對于關(guān)鍵位點(diǎn)的天冬酰胺，通常會(huì)將其脫酰胺化修飾作為CQA進(jìn)行監(jiān)控。天冬酰胺脫酰胺反應(yīng)是通過琥珀酰亞胺中間體進(jìn)行的，故在監(jiān)控脫酰胺的同時(shí)，也會(huì)一并監(jiān)控琥珀酰亞胺化比率。此處以重鏈CDR區(qū)的N55為例展示其脫酰胺化和琥珀酰亞胺化的定性定量結(jié)果。脫酰胺通常會(huì)導(dǎo)致酸峰比例的增高，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，相較于主峰，兩個(gè)酸峰中脫酰胺的比率均有顯著上升，分別為主峰中脫酰胺相對含量的4.86倍和5.26倍，且琥珀酰亞胺化比率的變化也呈對應(yīng)趨勢（圖8）。

圖8. 主峰和酸峰中重鏈N55脫酰胺化及琥珀酰亞胺化定性定量結(jié)果。

(A), 修飾比率變化在主峰及酸峰中的分布。(B)，主峰和酸峰中未修飾/脫酰胺修飾肽段對比。

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氧化同樣也是可能影響產(chǎn)品安全性和有效性的翻譯后修飾之一，所以我們選取了重鏈CDR區(qū)、Fc區(qū)和可能會(huì)影響帕博利珠單抗與PD-1結(jié)合的數(shù)個(gè)甲硫氨酸位點(diǎn)監(jiān)控氧化比率變化情況。如圖9所示，在堿峰中均可觀測到甲硫氨酸氧化比率明顯上升。

圖9. 所有峰中選定甲硫氨酸位點(diǎn)氧化定性定量結(jié)果。

(A), 全局圖。(B)， 相對含量小于6%部分的局部放大圖。

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