富士膠片株式會社 生命科學＆工程研究所

福地 大樹

◆前言

內毒素是存在于革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的脂多糖（Lipopolysaccharide），進入血液后，只需極少量即可引發(fā)出發(fā)熱癥狀，大量存在則表現出強毒性，可導致內毒素休克甚至死亡^1）。由于革蘭氏陰性菌廣泛分布于環(huán)境中，存在混入生產過程的風險，而混入的內毒素具有耐熱性，不易滅活，因此要求注射劑和醫(yī)療器械接受嚴密的內毒素污染管理。近年備受關注的再生醫(yī)療、疫苗、抗體和核酸醫(yī)藥相關的產品，內毒素管理對這類產品而言非常重要。

目前檢測主流是使用一種利用了馬蹄蟹血細胞提取物成分凝血系統(tǒng)的試劑——鱟試劑，來檢測內毒素，但為了保護鱟科、穩(wěn)定供應鱟試劑、減少產品批間差異、提高檢測穩(wěn)定性，各鱟試劑廠家開始促進使用人工原料生產的重組蛋白來研發(fā)內毒素檢測試劑。

◆內毒素檢查法的檢測原理

      內毒素檢查法是使用從馬蹄蟹血細胞成分制備得到的裂解試劑進行內毒素檢測或定量的方法。馬蹄蟹的血細胞提取物成分具有使內毒素凝固的反應體系，這種凝固反應以多個絲氨酸蛋白酶前體依次活化的級聯(lián)反應為基礎（圖1）。

      內毒素激活馬蹄蟹血細胞提取物中含有的C因子，隨后活化C因子激活B因子?；罨疊因子再激活凝血酶原，激活的凝血酶將凝血蛋白原底物水解，并將其轉化為凝固蛋白，生成不溶性凝膠。

      另外，在馬蹄蟹血細胞提取物中，級聯(lián)反應還會以G因子為起點，與β-葡聚糖發(fā)生反應，由β-葡聚糖引起凝血反應（圖1）。若想要特異性檢測內毒素，需要通過去除G因子或抑制以G因子為起點的級聯(lián)反應來檢測。

圖1. 由內毒素、β-葡聚糖引起的凝血級聯(lián)反應

◆內毒素的檢測方法

內毒素檢測大致可分為以下3種：凝膠法（以裂解物試劑的凝膠形成作為指標）、濁度法（檢測伴隨凝膠化變化的吸光度或透射率來測定濁度變化）、顯色法（以合成底物水解產生的顯色作為指標）。顯色法比凝膠法、濁度法的靈敏度要高。利用重組蛋白的內毒素檢測試劑中，除了使用顯色合成底物的顯色法之外，還有熒光合成底物的檢測方法。

◆利用重組蛋白的內毒素檢測試劑

      目前各公司銷售的重組蛋白內毒素檢測試劑可分為兩種，使用C因子重組蛋白的單因子鱟試劑和使用C因子、B因子、凝血酶原重組蛋白的三因子鱟試劑（圖2）。

      單因子試劑由于級聯(lián)反應沒有放大，產生的蛋白酶活性小，需要使用熒光底物進行熒光檢測。三因子體系試劑與單因子體系試劑相比，酶活性較大，可產生顯色反應，因此可以用普通的酶標儀來檢測。

      另外，近年有報告稱，B因子對內毒素的特異性具有重要作用^2，3），相比只含有C因子的單因子鱟試劑，含C因子、B因子和凝血酶原三因子鱟試劑更接近于天然鱟試劑。富士膠片和光一直致力于研發(fā)三因子重組鱟試劑，目前最新推出的使用重組蛋白的重組鱟試劑（PYROSTAR™ Neo），有著良好的檢測性能。

圖2. 利用重組蛋白的內毒素檢測試劑種類

◆PYROSTAR™ Neo

本次富士膠片和光發(fā)售的重組鱟試劑PYROSTAR™ Neo，具有以下的特點：對空白值進行了控制，空白值更低，因此可檢測到更低的內毒素濃度（表1）。另外，使用顯色法進行檢測是裂解試劑的常規(guī)分析方法之一，重組鱟試劑PYROSTAR™ Neo檢測和分析時可使用能夠進行動力學測定的恒溫酶標儀和軟件進行讀數。PYROSTAR™ Neo可以定量0.001 EU/mL~50 EU/mL范圍內的內毒素濃度，并能夠獲得線性良好的標準曲線（相關系數在0.980以上）。

表1. PYROSTAR™ Neo與其他公司產品的比較

◆結語

目前內毒素檢測試劑多為以鱟血為原料的裂解液鱟試劑，而使用人工重組蛋白的內毒素檢測試劑，其歷史較短，并未得到廣泛應用。

在此背景下，為推進重組鱟試劑的應用，2021年歐洲藥典收錄了采用熒光法的重組C因子鱟試劑并作為常規(guī)檢測方法。在日本藥典第十八次修訂的最新版本中，收錄了《內毒素檢測方法與使用重組鱟試劑的替代法》（「エンドトキシン試験法と測定試薬に遺伝子組換えタンパク質を用いる代替法」）作為補充參考信息，但重組鱟試劑并不屬于內毒素檢查法中規(guī)定的“馬蹄蟹血細胞提取物成分制備的裂解試劑”。同樣，美國藥典也將重組鱟試劑視為替代法。據報告，使用替代法時，相比使用裂解試劑的內毒素檢查法，需要對這兩種方法進行對比研究，確保重組鱟試劑有相同或更高水平的真實性、準確度、靈敏度、特異性等 ^4）。

今后富士膠片和光將會繼續(xù)推進重組鱟試劑應用于內毒素檢測中的研究，但需滿足真實性、準確度、靈敏度、特異性這幾點才能滿足考慮替代法的制藥公司等用戶的需求。我們將繼續(xù)推進鱟試劑的研究，努力實現用戶需求、環(huán)境和馬蹄蟹保護之間的平衡。

◆參考文獻

1）棚元憲一：エンドトキシンと醫(yī)薬品の品質管理，國立醫(yī)薬品食品衛(wèi)生研究所報告，126，19（2008）.

2）Kobayashi, Y. et al. : J. Biol. Chem., 290, 19379 (2015).

3）Tsuchiya, M. : Int. J. Dev. Res., 10, 36751 (2020).

4）菊池裕 他：醫(yī)薬品醫(yī)療機器レギュラトリーサイエンス，48，252（2017）.

◆相關產品

內毒素檢測重組鱟試劑 PYROSTAR™ Neo：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/908.html