層粘連蛋白521（LN521）是天然干細(xì)胞生態(tài)位的關(guān)鍵細(xì)胞粘附蛋白，是一種用于人胚胎（hES）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）培養(yǎng)和擴(kuò)增的基質(zhì)。LN521與細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活細(xì)胞信號(hào)通路，從而產(chǎn)生更多功能性細(xì)胞。

Laminin 521在體外重現(xiàn)生物學(xué)相關(guān)的hPSC環(huán)境，促進(jìn)hPSC的附著、高存活和強(qiáng)大的長(zhǎng)期自我更新，是支持干細(xì)胞生長(zhǎng)以及維持基底膜結(jié)構(gòu)和性能穩(wěn)定的關(guān)鍵基質(zhì)蛋白。Laminin 521也是目前常用的無(wú)滋養(yǎng)層培養(yǎng)基質(zhì)之一。此外，Laminin 521無(wú)需添加任何細(xì)胞凋亡抑制劑，即可實(shí)現(xiàn)遺傳穩(wěn)定和多能干細(xì)胞的高效單細(xì)胞傳代，細(xì)胞以均勻單細(xì)胞層生長(zhǎng)，無(wú)需手動(dòng)去除任何分化區(qū)域。另外，研究表明LN521可支持PSC生長(zhǎng)超過(guò)10代，且無(wú)任何核型異常跡象，并且保持PSC分化為內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的能力。

圖1.Laminin 521結(jié)構(gòu)[1]

1.1  將 iPSC 從液氮或干冰中取出 ，在 37°C水中解凍10 秒。

1.2  用75％酒精對(duì)冷凍管進(jìn)行消毒，并將其轉(zhuǎn)移到工作臺(tái)面上。

1.3  將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)新15 mL離心管中，離心管中含有9 mL DMEM?F12。

1.4  將15 mL離心管在室溫下以300g離心5min。

1.5  將已包被好的12孔板中的層粘連蛋白溶液棄去。

1.6  棄去細(xì)胞上清液，用1 mL  mTeSR-plus（含10 µM Y-27632 ）輕輕重懸 iPSC，然后將其轉(zhuǎn)移到已包被好的12孔板中。搖動(dòng)板以均勻分布細(xì)胞，最終細(xì)胞密度為1×10^5細(xì)胞/孔，靜置，室溫下放置10分鐘。確保培養(yǎng)在4~5天內(nèi)傳代。

表2.不同培養(yǎng)容器的細(xì)胞接種密度，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度確定細(xì)胞數(shù)量

1.7 將12孔板放回37°C培養(yǎng)箱孵育。

1.8 含ROCK抑制劑的培養(yǎng)基應(yīng)在12~16小時(shí)后除去，繼續(xù)在不含抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2.1 棄去培養(yǎng)上清，用1 mL PBS(Ca??/Mg??)沖洗。

注意：使用不含Ca2+ 和 Mg2+的PBS，因?yàn)槎r(jià)陽(yáng)離子對(duì)某些解離酶有負(fù)面影響。

2.2 棄去PBS，加入0.5 mL Gentle Cell Dissociation Reagent。室溫下放置6-8分鐘或放在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞不再結(jié)合到板上。

2.3 加入等體積的DMEM-F12，輕輕混勻細(xì)胞，在室溫轉(zhuǎn)移到離心管中，以300g離心5min。

2.4 在傳代細(xì)胞前，準(zhǔn)備一個(gè)層粘連蛋白包被的12孔板。

2.5  棄去上清液并用含有 10  µM  Y?27632  的 mTeSR?plus 培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。

2.6 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的層粘連蛋白包被的12孔板中。輕輕搖動(dòng)板以均勻分布細(xì)胞，并室溫下放置10至20分鐘。

2.7將12孔板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育。

注意：ipsc長(zhǎng)成單層后會(huì)迅速分化并死亡。為了保持生長(zhǎng)和多能性，需在其長(zhǎng)滿前進(jìn)行傳代。

3.1 準(zhǔn)備好溫和細(xì)胞解離試劑。
3.2 按照ipsc傳代方案進(jìn)行細(xì)胞分離，使用細(xì)胞器計(jì)數(shù)，確保冷凍保存前的細(xì)胞密度。
3.3 每管細(xì)胞應(yīng)以1-2×10^6細(xì)胞密度凍存。按照ipsc傳代方案中，離心、取出細(xì)胞培養(yǎng)基的步驟進(jìn)行。將分離的iPSC沉淀重懸于適當(dāng)體積的冷凍保存液中。
3.4 將1 mL 重懸的細(xì)胞冷沉淀加入1.5mL凍存管中，進(jìn)行程序降溫，然后轉(zhuǎn)移到到液氮中，長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

1.實(shí)驗(yàn)方案中的所有步驟均須在無(wú)菌條件下執(zhí)行。
2.避免層粘連蛋白長(zhǎng)時(shí)間暴露在室溫下。
3.應(yīng)避免反復(fù)凍融
4.解凍后，未稀釋的蛋白原液在無(wú)菌條件下儲(chǔ)存于 2~8℃保存，可穩(wěn)定保存至少3 個(gè)月。