抗體藥物是以細胞工程技術和基因工程技術為主體的抗體工程技術制備的藥物，具有特異性高、性質均一、可針對特定靶點定向制備等優(yōu)點，目前被廣泛用在抗腫瘤領域和自身免疫類領域的疾病治療中?；诳贵w的生物療法是制藥市場增長最快的細分市場之一，因其具有高選擇性和理想的藥理學特性，且同小分子藥相比，研發(fā)周期短、開發(fā)成功率高。根據(jù)Frost & Sullivan的統(tǒng)計預測，到2030年全球抗體藥物市場規(guī)模預計增至4,431億美元，中國的抗體藥物市場規(guī)模預計達5108億，CAGR近20%。

抗體類藥物可以分為：單克隆抗體、雙特異性抗體、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）、Fc融合蛋白、抗體片段和多克隆抗體等。目前全球及中國抗體藥物市場均以單克隆抗體為主，未來將向多特異性抗體發(fā)展，ADC藥物的市場規(guī)模國內外也都在迅速增長。

抗體藥物從早期研發(fā)、到成功上市需要經歷多個階段，每個階段都存在極其復雜的不確定性，需要對其中多個關鍵點進行嚴格的質量控制，從而確保最終產品的安全性和有效性。

圖1.抗體藥研發(fā)及生產流程中翌圣質控產品推薦

相較于傳統(tǒng)化學藥物，以基因治療、細胞治療或組織工程為基礎的新型生物治療業(yè)已成為前沿性治療藥物。這些藥物大多以細胞為載體制備或構建，因此，在此過程中，對于細胞種子庫、病毒培養(yǎng)和收獲、臨床治療用途的細胞等生物制品中生產制備過程易受到支原體污染。

支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對于涉及細胞培養(yǎng)的生物制品工藝過程，法規(guī)要求“必須確保無支原體污染”。目前國內外藥典推薦的支原體檢測方法主要是基于培養(yǎng)法、NAT(核酸擴增法)法、細胞培養(yǎng)指示法。

翌圣生物MycAway®支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)是基于NAT法的一種快速定性檢測生產原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液、治療用細胞中潛在支原體污染的產品。該試劑盒基于定量PCR技術，使用Taqman熒光探針定性檢測待測樣本中支原體DNA，可覆蓋183種支原體DNA序列；并且嚴格按照EP 2.6.7和JP G3支原體檢測相關指南和要求進行驗證，具備靈敏度高、特異性好、安全性好等特點。該試劑盒還能夠與MolPure®磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒搭配使用，通過手動提取或者使用自動化核酸提取儀自動提取樣本核酸，再由qPCR收集探針的熒光信號，從而對檢測結果進行判定。

圖2.翌圣生物NAT法支原體qPCR檢測實驗流程

去除宿主細胞雜質是抗體藥物在內的生物制藥產品生產中的關鍵步驟，其中宿主細胞殘留DNA由于可能存在的免疫原性、感染性以及致瘤性等安全問題成為關鍵質控指標。在此情況下，建立合適的檢測方法監(jiān)測生產工藝，控制宿主細胞殘留核酸限度，以確保產品的安全性和質量已經成為監(jiān)管機構和行業(yè)內關注的重點。

此外，《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規(guī)定，外源性DNA殘留檢測采用DNA探針雜交法、熒光染色法和定量PCR法。目前市場上對宿主細胞殘留DNA檢測，主要采用熒光探針qPCR方法，qPCR法具有的靈敏度、序列特異性和準確性，可為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質量控制方面提供可靠的檢測手段，現(xiàn)也已成為各生物制品廠家檢測方法。

翌圣生物自主研發(fā)的CHO宿主細胞殘留DNA的qPCR法檢測試劑盒，可快速高效檢測生物藥中宿主DNA殘留量。

圖3. CHO DNA (3G)標曲范圍3fg/μL~300pg/μL，擴增效率為99.29%，各濃度檢測值CV<15%

除需對DNA的殘留量進行控制外，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關風險因素的重要指標。有研究表明，一個功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp可能會有一定的致病性，且殘留DNA片段越大，生物制品的風險等級越高。

美國FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)》的行業(yè)指南中建議將非致瘤性連續(xù)細胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下，DNA大小限制在約200bp以下。

2022年5月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心（CDE）發(fā)布的體內基因治療產品要學研究與評價技術指導原則（試行）中也明確指出需對DNA殘留量和殘留片段大小進行控制，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。

目前，行業(yè)內對于殘留宿主細胞DNA片段分析，主要是利用毛細管電泳的方法。研究者們開發(fā)了一種基于毛細管凝膠電泳與敏感激光誘導熒光（CGE-LIF）檢測殘留DNA分子大小的方法，可以檢測生物制品中殘留DNA的大小，實驗表明，大多數(shù)宿主細胞殘留DNA片段大小為50～2 000bp。除了毛細管電泳法外，實時熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進行生物制品中生產用細胞相關的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡單，耗時更短。

針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了CHO殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理，設計了四種不同的擴增片段（94bp、115bp、252bp、505bp），用于定量檢測樣本中CHO宿主細胞殘留DNA片段的大小分布情況。

圖4. 宿主細胞中殘留DNA片段分析檢測流程圖

生物制品中HCP殘留含量通常被認為是產品的關鍵質量屬性(CQA)，是工藝穩(wěn)健性監(jiān)測的重要評價指標，也是產品的重要質控指標。各國法規(guī)都有涉及HCP的論述，要求必須對生物藥品進行分析和純化，以將宿主細胞蛋白HCP降低到可接受的水平。

《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定：針對CHO細胞，HCP殘留需要<0.05%（相當于小于500ppm）；針對E.coli，HCP殘留需要<0.01%。

美國藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCP，其含量應該低于檢測限（通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCP含量應小于100ng，也即<0.01%）。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測常用的方法，在2020版《中國藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測方法均為ELISA法。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發(fā)了包括CHO宿主細胞在內的多款HCP蛋白殘留量檢測試劑盒。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)，能夠高靈敏的檢測樣本中HCP殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優(yōu)化、中間工藝過程的雜質控制以及終產品的放行檢測。

圖5. 翌圣CHO HCP ELISA試劑盒產品特點

金黃色葡萄球菌細胞壁中的A蛋白（Staphylococal ProteinA，SPA）又稱Protein A，是一種金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質，42kDa，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結合，通常在大規(guī)模抗體制備中用于純化IgG。在抗體藥生產中，下游親和層析過程中Protein A會不可避免的與目標抗體蛋白一起被洗脫下來，從而在最終純化步驟中產生Protein A殘留。這種雜質會嚴重影響產品質量、藥效以及安全性。因此，國內外法規(guī)對殘留Protein A檢測以及殘留量標準均有相關文件出臺。

《中華人民共和國藥典》2020年版第三部《人用重組單克隆抗體制品總論》3.2.4 工藝相關雜質中提出“采用適宜的方法對供試品宿主蛋白質、宿主細胞和載體DNA、蛋白A及其他工藝相關雜質進行檢測”。

USP<130> PROTEIN A QUALITY ATTRIBUTES中提到希望廠家能夠在純化工藝中將脫落的protein A清除，生產工藝也需要進行相應驗證。

關于Protein A檢測方法和殘留限度，2020年版中國藥典三部《尼妥珠單抗注射液》3.1.3.3 蛋白質A殘留量中提出“用酶聯(lián)免疫吸附法（通則3429）測定，蛋白質A殘留量應不高于蛋白質總量的0.001%”。

目前，基于ELISA的殘留檢測基本上已被應用于工藝研發(fā)和驗證過程中以確保在蛋白A親和層析之后的過程步驟中能夠有效去除殘留蛋白A。翌圣自主研發(fā)的Protein A ELISA Kit正是采用ELISA方法，通過試劑盒中的標準品對樣品中的殘留protein A進行定量檢測。

圖6. 翌圣生物ELISA法檢測Protein A殘留量的實驗過程