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蛋白結(jié)構(gòu)研究分析
一、研究背景
上個世紀初，科學家們認為蛋白質(zhì)是生命體的遺傳物質(zhì)，而具有*的作用。隨著這個理論被證偽，真正的遺傳物質(zhì)DNA的結(jié)構(gòu)被給予了很大關注。然而，蛋白質(zhì)作為生命體的重要大分子，其重要性也從未被忽視，而且在1950年代開始，科學家一直在探尋DNA序列和蛋白質(zhì)序列的相關性。與此同時，蛋白質(zhì)測序和結(jié)構(gòu)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的努力開始慢慢獲得回報。更多的生化研究揭示了蛋白質(zhì)的功能重要性，因此蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的解析對于深入理解蛋白質(zhì)功能和生理現(xiàn)象起著決定性作用
圖1:蛋白三維結(jié)構(gòu)圖
二、蛋白結(jié)構(gòu)研究的發(fā)展
時間 | 科學家 | 事件 |
1958年 | John Kendrew和Max Perutz | X射線衍射得到的高分辨率的肌紅蛋白Myoglobin的三維結(jié)構(gòu)，然后是更加復雜的血紅蛋白Hemoglobin |
1964年 | Aaron Klug | 提出了一種基于X射線衍射原理發(fā)展而來的全新的方法電子晶體學顯微鏡（crystallographic electron microscopy ），可以解析更大蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)核酸復合體結(jié)構(gòu) |
1969年 | Benno P. Schoenborn | 提出可以用中子散射和原子核散射來確定大分子中固定位置的氫原子坐標。 |
1976年 | Robert Langride | 將X-ray衍射數(shù)據(jù)可視化，并在加州大學圣地亞哥分校成立了一個計算機圖形實驗室 |
1985年 | John Deisenhofer等 | 德國科學家解析出了細菌光合反應中心，因此他們共享了1988年的諾貝爾化學獎。 |
2001年 | Roger Kornberg | 描述了第—個高精度的RNA聚合酶三維結(jié)構(gòu)，正因此五年后他們共享了諾貝爾化學獎。 |
2007年，第—個G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)的解析更是對藥物研究帶了新的希望。近些年來，越來越多的大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到解析。Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像用于超大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成像的研究日益成熟，并開始廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析 | ||
三、蛋白結(jié)構(gòu)研究的意義
示例1：來自阿貢國家實驗室等處的研究者利用高特異性的X射線晶體學技術解析了低氧誘導性因子（HIFs）的蛋白結(jié)構(gòu)，低氧誘導性因子是腫瘤對低氧反應的重要調(diào)節(jié)子，該研究或為尋找新型藥物切斷癌細胞的氧氣和營養(yǎng)供給終治療癌癥提供新的思路。
示例2：A型流感病毒（Influenza A virus，IAV）屬于正黏病毒科，是一個有囊膜的、分節(jié)段的單股負鏈的RNA病毒，不同亞型流感病毒與受體的結(jié)合主要是靠HA蛋白實現(xiàn)的，HA與受體的結(jié)合具有種屬特異性。在H7N9亞型流感病毒HA在演化過程中，它首先由禽特異性結(jié)合的G186Q226變成雙受體結(jié)合特性的V186Q226，后演變成V186L226，這些研究有利于深入理解H7亞型禽流感病毒跨種傳播的分子機制，對于流感病毒疫情的預防與控制具有重要指導作用。
圖2:H7N9 HA受體結(jié)合特性演化模式圖
示例3：非洲豬瘟是一個世界難題，有近百年的流行歷史，由于沒有疫苗和其他治療手段，撲殺豬是眼下控制疫情zui有效的方法。2019年，研究團隊采用單顆粒三維重構(gòu)的方法*解析了非洲豬瘟病毒全顆粒的三維結(jié)構(gòu)，闡明了非洲豬瘟病毒*的5層（外膜、衣殼、雙層內(nèi)膜、核心殼層和基因組）結(jié)構(gòu)特征，有這個理論的指導，可以幫助我們未來設計更安全、更有效的疫苗，從范圍來講，理論的意義是非常大的。
圖3:非洲豬瘟的全顆粒結(jié)構(gòu)
四、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的研究過程和實驗方法
蛋白結(jié)構(gòu)分析包含一系列產(chǎn)品的選擇用于免疫印跡、蛋白電泳、蛋白定量、蛋白色譜、質(zhì)譜。
圖4:蛋白結(jié)構(gòu)研究過程
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要是兩種，x射線衍射和NMR。
1、單晶培養(yǎng)技術及結(jié)構(gòu)分析技術
1）蛋白質(zhì)結(jié)晶方法
2）結(jié)構(gòu)分析技術
（1）x射線衍射
x射線衍射是將表達蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達載體中，然后在大腸桿菌中誘導表達，提純之后摸索結(jié)晶條件，等拿到晶體之后，工作便完成的80%，將晶體進行x射線衍射，收集衍射圖譜，通過一系列的計算，很快就能得到蛋白質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)。
圖5:x射線衍射原理
（2）NMR
首先通過基因工程的方法，表達出目的蛋白，提純之后，摸索一下蛋白穩(wěn)定的條件，如果蛋白沒有聚合，而且折疊良好，便將蛋白樣品（通常是1mM～3mM，500ul，pH6～7的PBS）裝入核磁管中，放入核磁譜儀中，然后用一系列寫好的程序控制譜儀，發(fā)出一系列的電磁波，激發(fā)蛋白中的H、N13、C13原子，等電磁波發(fā)射完畢，在收集受激發(fā)的原子所放出的“能量”，其實也是小磁場，通過收集數(shù)據(jù)、譜圖處理、電腦計算從而得到蛋白的原子結(jié)構(gòu)。
圖6:血紅蛋白結(jié)構(gòu)建模
x射線與NMR技術特點
| 優(yōu)點 | 缺點 |
x射線衍射 | 速度快：通常只要拿到晶體，甚至當天就能得到結(jié)構(gòu) 不受大小限制：無論是多大的蛋白，或者復合體，無論是蛋白質(zhì)還是RNA、DNA，還是結(jié)合了什么小分子 | 射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結(jié)晶的條件， |
NMR | 蛋白在液體中得到結(jié)構(gòu)，是一個動態(tài)的結(jié)構(gòu)，因為是動態(tài)就很容易的研究蛋白與其他蛋白或者配基的相互作用。 | 受大小的限制（上限是50kd。） 蛋白表達量要大，一定要在胞質(zhì)中表達 蛋白要折疊。 |
（3）Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像
近些年來，Cryo-EM被用來解析很多結(jié)構(gòu)非常大（無法用X-ray解析）的蛋白質(zhì)（或者蛋白質(zhì)復合體），取得了非常好的結(jié)果。同時，單電子捕捉技術取代之前的光電轉(zhuǎn)換成像的CCD攝像設備，減少了圖像中的噪音和信號衰減，同時并增強了信號。計算機成像技術的成熟和進步，也賦予了Cryo-EM更多的進步空間。然而，Cyro-EM與X-ray不同，該方法不需要蛋白質(zhì)成為晶體，相同的是都需要低溫環(huán)境來減少粒子束對樣品的損害。
圖7:KIF1A殘基和微管蛋白之間的相互作用。
五、蛋白結(jié)構(gòu)相關產(chǎn)品信息
1、反轉(zhuǎn)錄
反轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄酶，合成DNA的過程。是DNA生物合成的一種特殊方式。反轉(zhuǎn)錄是進行基因工程過程中，以RNA為模板提取出DNA遺傳信息的過程。
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（¥） |
單酶 | HifairTM II Reverse Transcriptase | 11110ES92/93 | 1/5×10KU | 626/2456 |
高靈敏度單酶 | HifairTM III Reverse Transcriptase | 11111ES92/93 | 1/5×10KU | 1426/4626 |
Kit | HifairTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11119ES60 | 100T | 755 |
高靈敏度Kit | HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11135ES70 | 200T | 1836 |
Kit（含gDNA去除步驟） | HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11139ES70 | 200T | 2196 |
預混液 | HifairTM II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR | 11120ES60 | 100T | 855 |
高靈敏度預混液 | HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR | 11137ES70 | 200T | 2126 |
2、PCR試劑
聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的大特點是能將微量的DNA大幅增加。
相關產(chǎn)品
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（¥） |
基本PCR | HieffTM Taq DNA Polymerase | 10101ES80/90 | 1/5 KU | 155/735 |
HieffTM Robust PCR Master Mix（With Dye） | 10106ES08 | 5mL | 265 | |
高保真PCR | Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶 | 10135ES60/76/80 | 100/500/1000U | 626/2356/4256 |
Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶 | 10148ES60/76/80 | 100/500/1000U | 683/2383/4256 | |
2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix高保真酶預混液 | 10149ES03/08 | 1/5mL | 553/1453 | |
熱啟動型PCR | HieffTM HotStart Taq DNA Polymerase （配體法熱啟動DNA聚合酶） | 10110ES72/80 | 1/4×250U | 186 /636 |
多重PCR | 2× Hieff CanaceTM PCR Master Mix 高保真酶預混液 （for multiplex PCR） | 10138ES03/08 | 1/5mL | 625/2355 |
組織直擴PCR | Animal Tissue Direct PCR Kit 動物組織直接PCR試劑盒 | 10180ES50/70 | 50/200T | 326/755 |
Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye) | 10185ES50/70 | 50/200T | 323/982 |
3、分子克隆
在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復制與擴增，然后再從篩選的寄主細胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（¥） |
單個片段連接 | Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆試劑盒HOT | 10911ES25/62 | 25T/5×25T | 655/2455 |
1-5個片段連接 | Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆試劑盒HOT | 10912ES10/50 | 10T/5×10T | 457/1967 |
替代TA連接克隆 | Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒HOT | 10907ES20 | 20T | 625 |
Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit, MCS-Depleted 零背景TOPO-TA克隆試劑盒（不含MCS多克隆酶切位點） | 10908ES20 | 20T | 625 | |
替代平末端連接克隆 | Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒HOT | 10909ES20 | 20T | 625 |
Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒（不含MCS多克隆酶切位點） | 10910ES20 | 20T | 625 |
4、抗生素
抗生素，是指由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細胞發(fā)育功能的化學物質(zhì)。
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（¥） |
克隆篩選用抗生素 | Carbenicillin, Disodium Salt | 60202ES08/25/60 | 5/ 25/100g | 358/1428/4628 |
Ampicillin, Sodium Salt 氨芐青霉素鈉 | 60203ES10/60 | 10/100g | 108/968 |
5、蛋白濃度測定及SDS-PAGE膠
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（¥） |
蛋白提取 | RIPA Lysis Buffer (Strong) RIPA裂解液（強） | 20101ES60 | 100ml | 228 |
蛋白濃度測定 | BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型) | 20201ES76/86/90 | 500T/2500T/5000T | 288/818/1518 |
Bradford蛋白濃度測定試劑盒 | 20202ES76/86 | 500T/2500T | 98/398 | |
Marker | GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker（10-180 kDa）三色預染蛋白質(zhì)分子量標準 | 20351ES76/90 | 2×250/10×250 μL | 585/1985 |
GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker（10-245 kDa）三色預染蛋白質(zhì)分子量標準 | 20352ES76/90 | 2×250/10×250μL | 615/2315 | |
預制膠 | Precast Protein Improve Gels, 10 wells 高分辨率梯度預制膠,10孔 | 36231ES10 | 4%-20%，1盒（10塊） | 378 |
Precast Protein Improve Gels, 10 wells 高分辨率固定濃度預制膠,10孔 | 36233ES10 | 10%，1盒（10塊） | 378 |
6、蛋白純化
蛋白純化是生命科學研究領域中一項重要操作技術，其廣泛應用于蛋白功能、結(jié)構(gòu)和相互作用的研究。翊圣生物提供全線蛋白純化產(chǎn)品，包括純化樹脂、預裝柱和層析空柱等，可高效、便捷分離純化目的蛋白，為下游應用提供良好保證，更大范圍滿足您的實驗需求
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（¥） |
Flag親和純化凝膠 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag親和純化凝膠） | 20585ES03/08/25/60 | 1/5/25/100 mL | 1936/6236/27286/96756 |
His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂 | HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂） | 20502ES10/50/60 | 10/50/100 mL | 678/2848/5328 |
HisSep Ni-NTA Superflow Resin （His標簽蛋白瓊脂糖高速純化樹脂） | 20503ES10/50/60 | 10/50/100 mL | 798/3358/5838 | |
HisSep Ni-NTA 6FF Spin Column, 5ML（His標簽蛋白純化預裝柱） | 20504ES08/25 | 5/5×5 mL | 728/2938 | |
HisSep Ni-NTA 6FF Spin Column, 1ML（His標簽蛋白純化預裝柱） | 20505ES03/08 | 1/5×1 mL | 298/1048 | |
Imidazole咪唑 | 20501ES60/76 | 100/500 g | 223/553 | |
GST標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂 | GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽瓊脂糖樹脂 | 20507ES10/50/60 | 10/50/100 mL | 928/3848/6898 |
GSTSep Glutathione Superflow Resin 谷胱甘肽高速純化樹脂 | 20508ES10/50/60 | 10/50/100 mL | 1238/4568/7928 | |
GSTSep Glutathione 4FF Spin Column, 1ML（GST標簽蛋白純化預裝柱） | 20509ES03/08 | 1/5×1 mL | 328/1348 | |
GSTSep Glutathione 4FF Spin Column, 5ML（GST標簽蛋白純化預裝柱） | 20510ES08/25 | 5/5×5 mL | 938/3928 | |
Glutathione,Reduced (GSH) 還原型谷胱甘肽（GSH） | 60342ES10/60/80 | 10/100/1000 g | 209/1156/4596 | |
核酸酶 | Benzonase Nuclease (Endotoxin-free) 全能核酸酶無內(nèi)毒素 | 20125ES25/50/60 | 25/50/100 KU | 1125/1965/3245 |
Benzonase Nuclease 全能核酸酶 | 20156ES25/50/60 | 25/50/100 KU | 418/768/1398 |
六、其他產(chǎn)品
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（¥） |
普通PCR | HieffTM PCR Master Mix (With Dye) | 10102ES08 | 5mL | 150 |
HieffTM Robust PCR Master Mix（With Dye） | 10106ES08 | 5mL | 265 | |
HieffTM HotStart PCR Genotyping Master Mix（With Dye） | 10108ES08 | 5mL | 345 | |
高保真PCR | Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶 | 10148ES60/76/80 | 100/500/1000U | 683/2383/4256 |
2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix高保真酶預混液 | 10149ES03/08 | 1/5mL | 553/1453 | |
熱啟動型PCR | UNICON™ HotStart Taq DNA Polymerase （抗體法熱啟動Taq酶） | 10113ES60/76/88 | 100U/500U/3000U | 216/656/3665 |
2×UNICONTM HotStart PCR Master Mix (With Dye) | 10111ES03/08 | 5mL | 432 | |
2×UNICONTM HotStart PCR Master Mix（No dye） | 10112ES03/08 | 5mL | 432 | |
多重PCR | HieffTM Multiplex PCR Kit（Mg2+ free） | 13278ES50/76 | 100/500T | 875/3165 |
HieffTM Multiplex PCR Kit | 13279ES50/76 | 100/500T | 875/3165 | |
HieffTM Multiplex PCR Master Mix | 13280ES50/76 | 50/200T | 875/3165 | |
5× Hieff CanaceTM PCR Master Mix 高保真酶預混液 （for multiplex PCR） | 10137ES03/08 | 1/5mL | 1215/3065 | |
組織直擴PCR | Mouse Tissue Direct PCR Kit 小鼠組織直接PCR試劑盒 | 10181ES50/70 | 50T/200T | 326/755 |
Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR試劑盒 | 10182ES50/70 | 50T/200T | 326/755 | |
Plant Tissue PCR Kit 植物組織直接PCR試劑盒 | 10183ES50/70 | 50T/200T | 326/755 | |
其他克隆相關產(chǎn)品 | T4 DNA Ligase T4 DNA 連接酶HOT | 10301ES40 | 40KU | 446 |
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase TDT末端轉(zhuǎn)移酶 | 10302ES76 | 500U | 1156 | |
Taq DNA Ligase Taq DNA 連接酶HOT | 11051ES80/84/92 | 1/2/10KU | 346/656/2616 | |
*0 Chemically Competent Cell *0化學感受態(tài)細胞 | 11801ES80/92 | 10 /100×100μL | 166/1236 | |
DH5α Chemically Competent Cell DH5α化學感受態(tài)細胞 | 11802ES80/92 | 10/100×100μL | 166/1236 | |
X-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷 | 10901ES03/08 | 1/5g | 426/1746 | |
X-α-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷 | 10903ES25/60/72/76 | 25/100/250/500mg | 399/769/1259/1979 | |
蛋白標簽切割酶 | Enterokinase, Recombinant, Expressed in E. coli 大腸桿菌表達重組腸激酶（不帶標簽） | 20401ES60/70/76 | 100/200/500 U | 425/645/1245 |
Bovine Thrombin, High Specific Activity, >2000 IU/mg 牛凝血酶（高活力，>2000 IU/mg） | 20402ES03/05 | 1/2 KU | 536/956 | |
rTEV Protease 重組煙草蝕紋病毒蛋白酶 | 20403ES80/92/10/50 | 1/10/10×1/50 KU | 986/6756/7856/27556 |
HB191204
