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干細(xì)胞（Stem cells）是未分化的或部分分化的細(xì)胞,具有自我更新和多次分化的能力。在一定條件下，可分化成多種功能細(xì)胞。未充分分化的干細(xì)胞因具有再生各類組織器官和人體的潛在功能，被稱為“萬(wàn)用細(xì)胞"。常見(jiàn)干細(xì)胞培養(yǎng)有造血干細(xì)胞(HSC)，胚胎干細(xì)胞(ESC)，神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)，多功能干細(xì)胞(iPSC)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)等干細(xì)胞培養(yǎng)。由于干細(xì)胞具有再生組織和修復(fù)的潛力，來(lái)替換身體里受損或生病的細(xì)胞，因此在自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、心血管類疾病、骨骼系統(tǒng)疾病、眼科類疾病以及代謝性類疾病等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
圖.干細(xì)胞基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的重大發(fā)現(xiàn)和進(jìn)展的時(shí)間軸【1】
2006年，山中伸彌等科學(xué)家把4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)入小鼠的成纖維細(xì)胞，使其變成多功能干細(xì)胞（iPSC），意味著體細(xì)胞能夠被改造發(fā)展成所有類型細(xì)胞，開(kāi)啟了干細(xì)胞研究的新紀(jì)元，于2012年因該項(xiàng)成果發(fā)現(xiàn)榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。以“stem cell"作為關(guān)鍵詞，在clinicaltrials.gov網(wǎng)站中檢索到，截至2024年8月31日全球干細(xì)胞臨床試驗(yàn)有7253項(xiàng)，其中早期階段(145)、臨床I期(2,448)、II期(3,291)、III期(671)、IV期(166)。目前，國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)成立干細(xì)胞臨床研究備案機(jī)構(gòu)近150余家，通過(guò)審批備案的干細(xì)胞臨床研究已達(dá)140余項(xiàng)。干細(xì)胞研究已成為重要的方向，接下來(lái)小翌將帶你了解干細(xì)胞的整個(gè)培養(yǎng)流程，避免踩坑。
圖.用于干細(xì)胞治療的不同細(xì)胞來(lái)源示意圖【1】
復(fù) 蘇
稀釋前將Ceturegel®基質(zhì)膠和適量體積的DMEM/F12放入4度冰箱過(guò)夜融化。
將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3~4ml的H9全培養(yǎng)液的15ml離心管內(nèi)，以1000rpm，離心5min。
離心后將上清液吸除，輕彈離心管底，使細(xì)胞沉淀松散，加入新鮮的H9全培養(yǎng)液2~3ml，輕輕吹打一次使細(xì)胞克隆塊懸浮。
轉(zhuǎn)移至已經(jīng)鋪好Ceturegel®基質(zhì)膠的6孔板中培養(yǎng)。
復(fù)蘇第二天不換液，第三天起每天更換H9細(xì)胞全培養(yǎng)液。
注意：復(fù)蘇時(shí)不能吹打過(guò)度，不能吹打成單細(xì)胞，保持細(xì)胞克隆塊狀，復(fù)蘇后48小時(shí)換液，期間最好不要挪動(dòng)細(xì)胞。H9復(fù)蘇后可能4~5天才開(kāi)始有克隆出現(xiàn)，7-10天傳代（具體視克隆密度和大小而定）。
傳 代
一般在復(fù)蘇后第7~10天傳代，之后常規(guī)傳代為6-7天一次。
在顯微鏡下觀察，直至克隆脫落（一般需要3~6min）。
將帶有脫落克隆的消化液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，放置一會(huì)，待克隆自然沉降后將上層吸除，加入H9全培養(yǎng)液3ml輕輕混勻，放置一會(huì)，待克隆自然沉降后將上層培養(yǎng)液吸除，重復(fù)一次（即H9全培養(yǎng)液漂洗2遍，沉降后吸掉上清）。
加入H9全培養(yǎng)液3ml，用1ml移液器吹打2-3次，將克隆塊吹散成大小為原來(lái)的約1/10（若想得到大小較均一的克隆塊，此時(shí)可將細(xì)胞靜置片刻，待細(xì)胞自然沉降后取懸浮于液體中間層的克隆塊傳代），傳代比例根據(jù)母瓶克隆密度和大小而定，一般1:3~1:5傳代。
放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
第二天不換液，第三天起每天換液，換液前顯微鏡下將分化的克隆挑除。
注意：傳代時(shí)不能吹打過(guò)度，不能吹打成單細(xì)胞，保持細(xì)胞克隆塊狀，傳代后48小時(shí)換液，期間最好不要挪動(dòng)細(xì)胞。每6~7天傳代一次。
凍 存
按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái)，漂洗后細(xì)胞沉于離心管底部（上述傳代中步驟5）。
逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷（4℃）的細(xì)胞凍存液，一邊加一邊輕輕晃動(dòng)離心管。
1ml移液器輕輕混勻細(xì)胞（保持克隆塊，不可吹打過(guò)度），每支凍存管內(nèi)加入500ul~lml細(xì)胞懸液，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)入液氮。
圖.H9干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果示意圖
實(shí)驗(yàn)相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
Ceturegel® Matrix hESC-Qualified，LDEV-Free 基質(zhì)膠 | 40190ES08/10 | 5/10 mL |
NSC-27 supplement, serum free, 50X 無(wú)血清 NSC-27 添加劑 | 60703ES | 10 mL |
NSC-27 supplement without Vitamin A, serum free, 50X 無(wú)血清 NSC-27 添加劑,去除維生素A | 60704ES | 10 mL |
NSC-27 supplement without Antioxidant, serum free, 50X 無(wú)血清 NSC-27 添加劑,無(wú)抗氧化劑 | 60705ES | 10 mL |
NSC-27 supplement, serum free, 50X(animal origin-free)無(wú)血清 NSC-27 添加劑(非動(dòng)物源) | 60711ES | 10 mL |
NSC-27 supplement without Vitamin A, serum free, 50X(animal origin-free) 無(wú)血清 NSC-27 添加劑,去除維生素A(非動(dòng)物源） | 60712ES | 10 mL |
N-2 supplement,serum free,100X N-2無(wú)血清添加劑，100× | 60706ES | 5 mL |
N-2 supplement,serum free,100X N-2無(wú)血清添加劑,100X(非動(dòng)物源） | 60713ES | 5 mL |
DMEM/F-12 Reduced Serum Medium DMEM/F-12減血清培養(yǎng)基 | 41420ES76 | 500 mL |
參考文獻(xiàn)：
【1】HoangDM , PhamPT , BachTQ , NgoATL , NguyenQT . Stemcellbasedtherapyforhumandiseases . SignalTransductTargetTher . 2022Aug6 ; 7 (1) : 272 .doi : 10.1038 / s41392- 022- 01134- 4 . PMID : 35933430 ; PMCID : PMC9357075.
