實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用；實(shí)時(shí)熒光定量PCR：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，Z后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time Quantitative PCR）

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。相對定量用于測定一個(gè)測試樣本中目標(biāo)核酸序列與校正樣本中同一序列表達(dá)的相對變化。校正樣本可以是一個(gè)未經(jīng)處理的對照或者是在一個(gè)時(shí)辰研究中處于零時(shí)的樣本。

相對定量應(yīng)用（Relative Quantification，RQ）

非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBR Green

   SYBR Green特性：

（1）只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。

（2）變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光。

（3）在延伸結(jié)束階段采集熒光信號。

（4）SYBR Green也能和非特異性的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做熔解曲線分析。

相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量：
內(nèi)標(biāo)（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因，在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小，內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量。

 

相對定量分析方法：

2-ΔΔCt
前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)
  1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：
    ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test） 
    ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator） 
  2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT值：
         ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
  3、計(jì)算表達(dá)水平比率：
                    2 –ΔΔCT=表達(dá)量的比值

服務(wù)流程：

步驟	客 戶 提 供	服 務(wù) 內(nèi) 容	基 屹 提 供
1	新鮮的且盡量多的材料；已知的全長基因序列；盡可能詳細(xì)的背景資料：DNA/ RNA來源、豐度等。	DNA/RNA提取，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。
2	純化好的DNA/RNA（大于5 ug/樣品）；已知的全長基因序列；盡可能詳細(xì)的背景資料：DNA/ RNA來源、豐度等。	根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。
3		以DNA為模板，對目的基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測分析	提供完整的定量分析結(jié)果、實(shí)驗(yàn)熒光定量擴(kuò)增曲線及詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟。

注意：客戶可根據(jù)所能提供的起始材料不同，選擇從步驟1或2啟動(dòng)項(xiàng)目。