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今天與大家分享一篇發(fā)表于Cell子刊Cell Reports雜志上的文章，通訊作者為蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域的大師，來自德國慕尼黑工業(yè)大學的Bernhard Kuster教授；
主要內(nèi)容為基于質(zhì)譜的經(jīng)典蛋白質(zhì)組學和翻譯后修飾組學分析干細胞來源的肝細胞發(fā)育過程中蛋白的變化及階段性生物標志物的研究。
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圖1：實驗整體設(shè)計及iPSCs分化為肝細胞樣細胞過程概述
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為了便于閱讀，我們首先對文章中的實驗材料進行簡介：
人誘導多能干細胞( human induced pluripotent stem cells, iPSCs)為重編程體細胞，具有無限繁殖能力，其多能性使得經(jīng)誘導，分化為定型內(nèi)胚層(definitive endoderm ,DE)、肝內(nèi)胚層(hepatic endodermal ,HE)、未成熟肝細胞（immature hepatocyte, IH）、肝細胞樣細胞(hepatocyte-like cells，MH),分化過程如圖1所示。具體為通過誘導分化，在對應(yīng)的在不同時間點收取細胞，0天 iPSC細胞, 第6天 DE階段細胞, 第8天 HE階段細胞, 第13 天IH階段細胞以及第 21天 MH階段細胞。成人及胎肝細胞則由分離獲得。
肝細胞是肝臟實質(zhì)細胞，負責執(zhí)行大多數(shù)的肝臟的功能。肝臟還負擔了重要的外源物質(zhì)的解毒的作用，使得肝細胞在藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)中，原代人肝細胞(Primary human hepatocytes, PHHs)更是評估藥物代謝和毒性的金標準，但受限于材料短缺、在體外培養(yǎng)過程中的潛在變化以及捐獻者之間的高度異質(zhì)性等問題。故經(jīng)iPSCs分化的肝細胞樣細胞可作為替代方案，成為藥物評估等實驗的反應(yīng)容器，因此對iPSCs分化過程的研究至關(guān)重要。
我們知道，蛋白是生命活動的執(zhí)行者，翻譯后修飾更是具有極其高效的、物美價廉的調(diào)節(jié)作用。本篇文章中，作者使用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學作為研究工具，分析誘導多能干細胞分化為肝細胞的分子過程，共鑒定到約9000個蛋白以及12000個磷酸化位點和800個乙酰化位點，如圖2所示。
基于獲得的蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了在干細胞的分化過程中的一系列階段特異性的標志物蛋白。該研究構(gòu)建了肝細胞發(fā)育過程分子路線圖，對iPSCs的分化路徑進行深度解析，為未來相關(guān)研究提供寶貴數(shù)據(jù)資源。本篇文章內(nèi)容豐富詳實，分析全面，也是挖掘組學數(shù)據(jù)的經(jīng)dian范例。
圖2：蛋白質(zhì)組學工作流程概述
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具體來說，在時間維度分辨的iPSCs到肝細胞的分化過程的定量蛋白質(zhì)組學研究中，作者使用了TMT標記的策略，并使用TMT SPS-MS3的采集策略，獲得了肝細胞分化過程中的全面蛋白質(zhì)組學圖譜。共鑒定到約9000個蛋白以及12000個磷酸化位點和800個乙?；稽c。本組數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)異，其蛋白及修飾位點鑒定定量重復性高，并從PCA圖可看到，蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)重現(xiàn)了分化過程中的細胞轉(zhuǎn)變；而轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達的關(guān)系較弱，而比較有趣的是，蛋白表達和mRNA表達水平zui相關(guān)的階段是在分化上相距最遠的兩個階段（iPSC和MH），這也說明mRNA數(shù)據(jù)不足以研究細胞在分化過程中的時間動態(tài)變化。而蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)揭示動態(tài)變化明顯更加得心應(yīng)手。
將在分化過程中的差異蛋白水平數(shù)據(jù)進行分析，共計4956個蛋白，可被區(qū)分為10個聚類，有趣的是，TCA循環(huán)中的所有檢測到的13種蛋白，協(xié)同上調(diào)；琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDHA/B)的上調(diào)變化以及多種呼吸酶的表達量上調(diào)，連接了TCA循環(huán)和呼吸鏈，表明細胞代謝在IH階段中轉(zhuǎn)換到了氧化磷酸化。另一個被富集的通路是過氧化物酶體代謝途徑，其在脂肪酸代謝中具有關(guān)鍵作用，轉(zhuǎn)錄因子PPARα的上調(diào)表達，在細胞從HE到IH階段的代謝轉(zhuǎn)換中起到重要作用。
圖3：時間維度的代謝轉(zhuǎn)換
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在細胞周期的調(diào)控中，磷酸化調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，且其變化會優(yōu)先于蛋白水平。從iPSC到DE的轉(zhuǎn)化中，RB1-S807/811 和 CDK1-T161磷酸化水平均降低，提示說明早期的翻譯后修飾調(diào)節(jié)通過抑制G1/S和G2/M檢查點來進行的。因為過度磷酸化的RB1無法結(jié)合調(diào)控G1/S進程的轉(zhuǎn)錄因子E2F，而未磷酸化的蛋白可以結(jié)合E2F，從而阻止細胞周期。G2/M檢查點是細胞周期的第二個關(guān)鍵調(diào)節(jié)點，主要由CDK1控制。CDK1的主要的周期蛋白CCNB1的水平在iPSC和DE之間顯著降低，在分化過程中大量已知和預測的CDK1底物的磷酸化水平也均降低。
圖4：蛋白表達量及磷酸化水平變化調(diào)控細胞周期進程
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在iPSC分化過程中，將表達的蛋白根據(jù)不同的生物學功能進行區(qū)分。位于細胞表面的蛋白的表達量隨著分化時間的推進而升高，特別是作為“細胞表面"蛋白的子集的溶酶體蛋白的表達量明顯隨著分化進程升高。蛋白質(zhì)組學中觀察到的諸多“非規(guī)范的"功能變化，都反映了溶酶體是分化過程中的重要細胞器，共鑒定到726種細胞表面蛋白，其中97種都在分化過程中發(fā)生了量的變化；這些蛋白的變化趨勢，未來可能可以為控制細胞分化進程或純化特定細胞群體的研究提供幫助。
在不同分化階段時間維度的組學分析中，作者以兩倍差異作為標準，篩選到了共計78個階段性的差異表達蛋白，這些蛋白可以作為將來研究分化過程的起點。大多數(shù)標志物主要來源于起始分化的iPSCs或者終末的MHs，而處于分化中間階段的標志物蛋白發(fā)現(xiàn)較少，這個主要由于細胞的異質(zhì)性，目前的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學方式較難進行分析。長鏈脂肪酸生物合成中的速率限制酶ACACA是iPSCs階段的標志性蛋白之一，代表了這一時期的脂肪酸合成升高的事件。而在DE階段急劇下降的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B，這是細胞維持甲基化所必須的。而對于越過iPSCs階段后，蛋白DNMT3A的延長表達則能表明其在肝細胞分化中的特殊作用。組學數(shù)據(jù)表明，E-cadherin表達水平降低，間充質(zhì)標記物則表達水平上升，說明細胞從iPSCs經(jīng)EMT后再向DE階段發(fā)展。與癌癥表型相關(guān)聯(lián)的GAB2蛋白同時也是DE階段的標志物蛋白。ESRRG則是wei一在HE階段特異性和高表達的蛋白，在生物體發(fā)育中起到特定的作用。對于大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄因子，則會在細胞逐漸成熟時減少，且在HE到IH階段之間尤為顯著。對于MH階段來說，找到的78個階段性差異蛋白中，有52個是MH階段特異的；且有19個蛋白與免疫功能相關(guān)，這也與肝臟的免疫功能相對應(yīng)。如在尿素循環(huán)中第一步的酶CPS1，在MH階段上調(diào)16倍，而這可能跟肝臟的排毒功能對對應(yīng)。
圖5：時間維度分析中的標志物蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的變化趨勢（點擊查看大圖）
Wnt通路是一個在進化上高度保守的經(jīng)典的信號通路，調(diào)控細胞周期、影響細胞分化。在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)，Wnt通路在iPSC分化中至關(guān)重要。組學數(shù)據(jù)揭示了多種Wnt信號調(diào)控因子的表達變化，包括標記蛋白在所有階段的表達變化。如Wnt受體FZD5是DE期的階段特異性標志物。而在DE期之后的HE階段，F(xiàn)ZD5再次下調(diào)，而抑制Wnt的ESRRG 和WNT11上調(diào)，表明Wnt信號在進一步的肝細胞成熟過程中不會持續(xù)。除了Wnt通路外，數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)了多個與肝細胞分化相關(guān)的已知和必要信號通路相關(guān)的蛋白質(zhì)和磷酸化位點的顯著變化。
圖6：Wnt通路相關(guān)蛋白的變化及與肝細胞分化相關(guān)的顯著變化的通路
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與傳統(tǒng)的單層細胞培養(yǎng)方法相比，3D培養(yǎng)的細胞可以更加貼合于細胞的體內(nèi)環(huán)境，保持細胞間的相互作用，更好的模擬細胞的生理生化反應(yīng)，使得細胞對體內(nèi)外的刺激能有更接近于體內(nèi)的應(yīng)答。用來源于iPSC的HE期細胞、內(nèi)皮細胞和間充質(zhì)細胞組成的器官樣結(jié)構(gòu)，來研究2D培養(yǎng)及3D體外培養(yǎng)的肝細胞與胎肝及原發(fā)性人肝細胞（Primary human hepatocytes, PHH）（它是研究乙肝病毒感染的經(jīng)典體外感染模型）之間的異同。
作者同樣對其進行了深度蛋白質(zhì)組學和磷酸化蛋白質(zhì)組學的研究，共鑒定到8800個蛋白和12700個磷酸化位點。如PCA分析結(jié)果可得，幾種不同的材料的數(shù)據(jù)可清晰分開，展示了肝細胞在體內(nèi)的成熟過程。與其他的任何器官相比，2D和3D的培養(yǎng)的細胞的階段特異性標記蛋白都更為接近人肝臟組織，且3D細胞的標記蛋白對此更加特異。而對于體內(nèi)外數(shù)據(jù)與PHH的比較中，數(shù)據(jù)層面不管是選取強度前25個蛋白或者是表達量最高的1000個蛋白，從2D培養(yǎng)到3D培養(yǎng)到胎肝，其差異均呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，證實3D培養(yǎng)的細胞在分子層面確實更加接近于真實的胎肝或成人肝臟細胞。另一方面，藥物的“吸收-分布-代謝-排泄-毒性" 藥物動力學方法，對評估生物活性化合物能否被開發(fā)為治療藥物至關(guān)重要，所以也應(yīng)用蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)對此方面進行了解析。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)與此相關(guān)的蛋白僅在PHH中呈現(xiàn)高表達，數(shù)據(jù)表明，在特定的蛋白表達量上，不論是2D還是3D培養(yǎng)的由iPSC衍生的肝細胞的蛋白表達與PHH均有差別。
圖7：不同培養(yǎng)模式肝細胞的比較分析
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結(jié)語 /conclusion/
對于發(fā)育生物學和再生醫(yī)學來說，細胞如何變得特化或“成熟"的機制很重要。這篇文章，為我們地圖式的展示了干細胞來源的肝細胞發(fā)育過程中蛋白表達及翻譯后修飾水平的變化，并對組學數(shù)據(jù)進行了詳盡的分析與挖掘，并與前人的一些工作進行整合分析、比對，對數(shù)據(jù)進行了很好的分析利用，將蛋白質(zhì)表達量的變化與與細胞所處的時期、發(fā)揮的功能進行聯(lián)系，為將來更深入的細胞分化機理研究打下基礎(chǔ)。在蛋白質(zhì)組學及翻譯后修飾組的研究中，我們可以得到在轉(zhuǎn)錄組學中無法得到的信息；數(shù)據(jù)中還給到了隨著分化過程的時間特異的標志物蛋白等一系列信息，希望這些數(shù)據(jù)可以進一步用于開發(fā)改進細胞的分化方案。
就本文來說，肝臟細胞的來源短缺以及肝組織體外模型的缺失嚴重制約了藥物篩選及毒理研究，我們希望尋找更好的替代方案；組學數(shù)據(jù)表明，雖然3D培養(yǎng)略好，但于我們現(xiàn)在應(yīng)用的細胞模型與真實的細胞環(huán)境之前還有很大差別，這也為將來的如藥物評估等研究提出了疑問與更高的要求。
目前，基于質(zhì)譜的經(jīng)典的定量蛋白質(zhì)組學及翻譯后修飾組學，走向了復雜的再生醫(yī)學領(lǐng)域。相關(guān)研究包括類器官等相關(guān)的蛋白質(zhì)組學研究也多了起來，包括對揭示SARS-CoV-2感染機制等類器官相關(guān)文獻也多有報道；類器官能夠高度模擬體內(nèi)環(huán)境，并在體外能夠真實的展現(xiàn)器官的結(jié)構(gòu)和功能，目前類器官在構(gòu)建應(yīng)用于藥物敏感性研究或者疾病分子機理蓬勃發(fā)展，我們也希望技術(shù)的發(fā)展能為更多的生物學研究，甚至體外再造組織、器官等提供更多的幫助。
參考文獻
[1] Krumm J, Sekine K, Samaras P, Brazovskaja A, Breunig M, Yasui R, Kleger A, Taniguchi H, Wilhelm M, Treutlein B, Camp JG, Kuster B. High temporal resolution proteome and phosphoproteome profiling of stem cell-derived hepatocyte development. Cell Rep. 2022 Mar 29;38(13):110604. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110604. PMID: 35354033.
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